调神益肾针法对更年期大鼠卵巢、肾上腺3-羟利湿脱氢酶的影响.docxVIP

调神益肾针法对更年期大鼠卵巢、肾上腺3-羟利湿脱氢酶的影响 调神益肾法是治疗月经综合征的有效方法。据实验，它可能与针灸可以改善卵巢和肾上腺的形态功能有关，并增加血清二醇（e3）的水平有关。为进一步揭示调神益肾针法的作用机制,本研究运用细胞酶化学技术,观察了更年期大鼠卵巢、肾上腺中3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSDH)的变化规律及针刺干预效应。 1 材料表面 1.1 wist大鼠 选用4月龄雌性Wistar大鼠15只,体重169～188g;16月龄雌性Wistar大鼠30只,体重280～302g。均由天津市劳动职业病卫生研究所动物室提供。喂养在12小时光照、12小时黑暗的条件下,自由摄食、饮水,室温控制在22～28℃。 1.2 色病理图分析系统 冰冻切片机,德国Reichert-Jung公司;Olympus BH-2显微镜,日本Olympus公司;HPIAS-100高清晰度彩色病理图文分析系统,武汉同济医科大学千屏影像公司。去氢表雄酮(Trans-Dehydroandrosterone)、二甲基甲酰氨(N,N-Dimethy Formamide,DMF)、氧化型辅酶Ⅱ(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADP)、氯化硝基四氮唑蓝(Nitro Blue Tetrazolium,NBT),Sigma公司,分析纯。 1.3 动物模型 采用自然老化的更年期大鼠模型。 2 方法 2.1 大鼠穴位图谱 购进的动物适应性喂养1周后,30只16月龄大鼠随机分为更年组15只、针刺组15只,15只4月龄大鼠作为青年组。 针刺组根据华兴邦等制定的大鼠穴位图谱,选取风府、百会、气海、肾俞穴。其中风府缓慢向下直刺0.2cm,百会向后平刺0.5cm,气海直刺0.5cm,均行中等幅度的提插捻转手法,平补平泻;肾俞向脊柱方向斜刺0.5cm,行小幅度高频捻转补法。均留针20分钟,中间行针2次,加强刺激。每日1次,连续6天,中间休息1天,4周为1个疗程。青年组、更年组动物每天只进行抓取刺激,不做针刺。 2.2 进行“权” 为避免日夜节律对观察指标的影响,标本采集均在上午9:00～11:00进行。待针刺组动物接受针刺刺激满1个疗程后,所有大鼠断头处死,迅速摘取卵巢、肾上腺,置液氮内速冻,冰冻切片机-20℃切片。 2.3 d-sdh的制备 Lojda法显示3β-HSDH:切片入冷丙酮溶去脂滴;入3β-HSDH染色孵育液(包括去氢表雄酮、DMF、磷酸缓冲液、NBT、NADP、双蒸水等),37℃恒温孵育1小时;蒸馏水漂洗,10%生理盐水甲醛固定;蒸馏水漂洗,甘油明胶封片。光镜下观察,切片上含3β-HSDH的细胞质呈蓝紫色。 计算机图像分析:在放大倍数为400倍的条件下,每组切片每个观察项目按统一标准随机截取20个视野,在控制其灰度值一致的基础上,测定阳性反应物面积、积分光度值。 2.4 统计方法 数据用平均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,组间比较采用方差分析。 3 结果 3.1 各组大鼠膜黄原理比较 青年组大鼠窦状卵泡中围绕在卵泡周围的内泡膜细胞胞质阳性反应较强,颗粒细胞胞质阳性反应较弱,且卵泡腔周围细胞的反应弱于靠近卵泡壁细胞;成熟黄体中颗粒黄体细胞胞质均有较强阳性反应,膜黄体细胞仅部分细胞胞质有较弱阳性反应;间质腺细胞胞质均有较强阳性反应;而退化黄体、窦前卵泡、各级卵泡中的卵母细胞、卵巢结缔组织等均呈阴性反应。更年组大鼠窦状卵泡、成熟黄体阳性反应模式与青年组类似,但反应面积、强度较青年组明显降低(P0.05或P0.01);间质腺细胞胞质反应面积、强度与青年组类似。针刺组大鼠窦状卵泡、成熟黄体阳性反应模式与青年组、更年组类似,但反应面积、强度较更年组明显增加(P0.05或P0.01);间质腺细胞胞质反应面积也较更年组明显增加(P0.05)。见表1。 3.2 脏器脏器的阳性反应面积 青年组大鼠肾上腺球状带、束状带、网状带的细胞胞质均为阳性反应,而被膜、髓质为阴性反应。更年组大鼠肾上腺束状带、网状带细胞的阳性反应面积与青年组类似(因球状带细胞内缺乏17α-羟化酶,孕烯醇酮或孕酮不能在该部位转变为E2及其前体物质,故未将其作为观察对象)。针刺组大鼠肾上腺束状带、网状带细胞的阳性反应面积、强度明显高于更年组(P0.05)及青年组(P0.05或P0.01)。见表2。 4 针刺对大鼠卵巢、肝肾功能的影响 女性进入更年期后,由于卵巢功能减退,体内雌激素水平降低,生殖道、下丘脑、垂体、心血管、骨骼、大脑等效应器官或部位失去有效支持,正常的形态、功能发生改变,从而导致更年期综合征及与更年期密切相关疾病的发生。雌激素属类固醇激素,主要在卵巢、肾上腺中合成,胆固醇是其合成原料。胆固醇转变为雌激素需经过一系列酶促反应,其中3β-