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rp-hplc法测定苦木药材中4-甲氧基-5-羟基铁肚米酮的含量 苦木是苦木科植物苦木的干燥枝条和叶子，以苦食而闻名。具有清热、除湿、解毒消肿的功效。用于风热、感冒、咽喉痛、湿热、腹泻、湿热、伤害等。苦木主要分布于我国黄河流域以南各省区,其中广东和广西的山区资源比较丰富,生长在山坡、山谷及村边较潮湿处,我国川陕地区分布也较多,药源十分丰富。 苦木化学成分主要包括生物碱、苦味素、苦木内酯等。作者在对苦木化学成分进行了系统分离和结构鉴定的基础上,发现了4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮是苦木药材的主要化学成分,具有显著的抑菌作用,并且以往文献中并无简便的苦木药材中4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮的含量测定方法,因此,本文把其作为苦木的活性成分,探索了一种简便的含量测定方法并测定它在不同来源苦木中的含量。由于2010年版中国药典中还没有苦木药材的含量测定项,属标准缺项药材,本文所建立的方法将为2015年版中国药典中苦木的质量控制和评价提供参考。 1 材料、药品和试剂 Waters Alliance 2695高效液相色谱仪,包括Waters 2487紫外检测器,Empower色谱工作站;赛多利斯 BT25S(max=21 g, d=0.01 mg) 和天东衡 HTX 1001 T 型(max=1 kg, d= 0.1 g)电子天平;昆山KQ-500 DE型数控超声波清洗机;美国MILLI-PORE公司超纯水发生器。 苦木药材样品购自西安万寿路药材市场,经陕西省生物医药重点实验室王亚洲副教授鉴定为苦木科植物苦木Picrasma quassioides(D. Don) Benn.的干燥枝及茎。对照品4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮为实验室自制,并经UV、IR、NMR鉴定结构;HPLC检测,面积归一化法计算纯度,均99%。甲醇和乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司),冰醋酸为分析纯(西安化学试剂厂),水为超纯水 (自制,并经0.45 μm水系滤膜过滤)。 2 方法和结果 2.1 色谱柱的制备 精密称取4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮4.80 mg于20 mL量瓶中,以甲醇定容制成对照品溶液,4 ℃冷藏,备用。 精密称取苦木药材粉末(过20目筛)约1.0 g于具塞三角瓶中,加入甲醇20 mL后称定重量,超声(400 W,40 kHz)处理30 min,放置至室温,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀并静置后取上清液约1.5 mL,微孔滤膜(0.45 μm)过滤,即得。 色谱柱:Welchrom C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1% 醋酸水溶液(30∶70);流速:1.0 mL·min-1;紫外检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。 2.3 仪器精密度与回收率 分别取对照品储备液、供试品溶液各20 μL,按“2.2”项下色谱条件测定,记录色谱图 (见图1),药材中其他色谱峰对4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮色谱峰无干扰,理论塔板数为3136,4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮色谱峰能达到基线分离,峰形对称,基线平稳。 分别精密吸取对照品储备液适量,以甲醇配制成浓度为12.0,24.0,48.0,96.0,144.0,192.0,240 μg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密吸取上述溶液20 μL进样,以峰面积积分值Y为纵坐标,以进样浓度X(μg·mL-1)为横坐标进行线性回归,结果4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮回归方程为: Y=7.617×104X+1.150×105r=0.9999 4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮进样浓度在12.0～240.0 μg·mL-1的范围内与峰面积的积分值具有良好的线性关系。 精密吸取对照品溶液20 μL,按“2.2”项下色谱条件,连续进样6次,测定4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮峰面积值的RSD为0.5%,表明仪器精密度良好。 精密称取1号样品粉末约1.0 g共6份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样分析,计算样品4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮峰面积值的RSD为1.2%。说明该方法的重复性良好。 取同一供试品溶液20 μL,分别于0,2,4,8,12,24 h在上述色谱条件下进样测定,记录峰面积。计算样品中4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮峰面积的RSD为1.3 %,表明供试品溶液在24 h内稳定。 精密称取已知含量的2号苦木样品粉末约0.5 g,共6份,每份分别加入浓度为32.4 μg·mL-1的4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮对照品溶液20 mL,按“2.1.2”项下方法制备溶液,按“2.2”项下色谱条件测定,计算回收率(n=6)。结果4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮的回收率为101.2%,RSD为2.3%。 取不同产地的苦木样品各3份,分别按“2.1.2”项下方