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温度对离体条件下尿酸盐结晶沉积的影响 高尿酸血症患者中的疼痛风性关节炎发生率仅为10%20%，其原因尚不清楚。主要问题是不知道是什么使得关节腔中的钠胺结晶积聚。本实验室曾建立了持续性高尿酸血症模型, 虽然造模后血清尿酸水平持续升高, 但几乎未见动物有类似关节炎的表现。根据临床痛风性关节炎患者发病特点, 本室对持续性高尿酸血症模型大鼠附加冷水游泳条件, 结果可见, 高尿酸血症模型大鼠关节出现明显肿胀。为了解释这一现象, 探索高尿酸血症并发痛风性关节炎的病理生理机制, 借助体外试验方法, 选取人工关节液为研究基质, 通过调整温度, 观察尿酸在人工关节液中形成结晶的情况。通过大鼠离体后肢灌流试验, 进一步考察在离体条件下, 温度对关节腔中尿酸浓度的影响。 1 材料和方法 1.1 酸、肝素钠注射液 尿酸酶抑制剂 (uricase inhibitor , UI) , Sigma-Aldrich公司, 批号:S27869-095;次黄嘌呤 (Hypoxanthine , HX) , 南京鼎润生物技术有限公司, 批号:玻璃酸钠注射液 (即:人工关节液) , 山东博士伦福瑞达制药有限公司, 批号尿酸, ICN Biomedicals Inc, 批号:103215;尿酸试剂盒, 上海复星长征医学科学有限公司, 批号:D090271;肝素钠注射液, 中国江苏常州千红生化制药有限公司, 批号:060927。 洛氏液配制:洛氏液 (g/L) 组成成分 (氯化钠 9.0 氯化钾0.42 氯化钙0.24 碳酸氢钠0.15 葡萄糖2.27) , 用新鲜蒸馏水溶解, 碳酸氢钠先溶解后再逐滴加入已溶好的氯化钙中, 边加边振荡, 以免产生混浊。临用前加入葡萄糖。将不同重量的尿酸固体分别加入到洛氏液中, 调pH至7.4, 放入37℃水浴中待完全溶解, 分别得到UA浓度为500μmol/L、1000μmol/L、1600μmol/L的尿酸溶液。 1.2 实验动物 清洁级大鼠, 体重300±20g, 雄性。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供, 实验动物饲养许可证号为:SCXK (沪) 2007-0005。 1.3 ph/mv/测定方法 日立-7020全自动生化分析仪, 日立仪器 (苏州) 有限公司。HSS-1 (B) 型恒温浴槽, 成都仪器厂。HI8424NEW 便携式防水型Ph/mV/℃测定仪, 北京哈纳科仪科技有限公司。偏光显微镜Axio Imager M1, 德国蔡司仪器有限公司。 1.4 方法 1.4.1 尿酸浓度的影响 参照文献资料, 制备大鼠高尿酸血清, 全自动生化分析仪测定血清UA值, 获得UA浓度为2400μmol/L的血清, 备用。将人工关节液5ml在室温25℃静置10min, 测PH为7.5。取正常人工关节液3份, 每份0.5ml, 分别加入0.25ml高尿酸血清, 在高速混匀机上震荡2min后, 制备出尿酸浓度为800μmol/L的人工关节液溶液, 分别放入37℃、32℃、27℃恒温浴槽中, 水浴48h后, 测各组关节液中UA, 考察尿酸浓度为800μmol/L的人工关节液溶液在不同温度的影响下, 尿酸浓度的变化。另取人工关节液各10μL涂片, 在光学显微镜下 (×400) 观察是否有结晶生成, 根据结晶数目评分。每张涂片随机取3个视野, 以3个视野结晶数的均值作为评分的依据, 见表1。 1.4.2 离体标本的分离和纯化 参考文献资料, 大鼠腹腔注射肝素5mg/kg, 15min后, 以10%水合氯醛麻醉, 固定, 打开腹腔, 找到直肠, 双道结扎, 于两结扎线间剪断。移去肠管, 可见腹主动脉和下腔静脉。在肾血管水平仔细找到肠系膜上动脉 (相当于肾血管水平, 由腹主动脉分出向左行走) ;在腹主动脉分为二髂总动脉处找到肠系膜下动脉 (由靠近左髂总动脉处分出) , 分别结扎并剪断。分离腹主动脉和下腔静脉, 于肾血管水平以下的腹主动脉和下腔静脉下各预置二线, 结扎近心端, 分别向腹主动脉和下腔静脉的远心端插管, 扎紧, 固定。向腹主动脉套管中注射肝素, 下腔静脉套管中流出, 防止插管中血液凝固。剪断脊髓等上半身组织, 先用注射器把灌流液注入套管, 冲洗血管内的血液, 直至流出液澄清为止。然后将腹主动脉套管与恒压灌流装置相连, 将标本固定于鼠板上, 使灌流液流速保持在0.5ml/min, 将下肢流出的灌流液经下腔静脉套管引至一容器收集。将两后肢分别插入控制好温度的U形浴槽中 (浴槽的外槽内盛有自来水) , 经由HSS-1 (B) 型恒温浴槽使水温保持在20℃、27℃、37℃。将离体标本随机分为空白组、低、中、高浓度组, 每组6只。分别用洛氏液、浓度为500μmol/L、1000μmol/L、1600μmol/L