活体红色荧光成像技术评估dna疫苗对小鼠膀胱癌移植瘤的免疫治疗效果.docxVIP

活体红色荧光成像技术评估dna疫苗对小鼠膀胱癌移植瘤的免疫治疗效果 膀胱癌是排尿中最常见的肿瘤之一。治疗的首选方法是对膀胱内肿瘤进行切除，但术后复发率为40%75%。术后膀胱内灌注药物治疗可降低或延缓肿瘤复发,但目前评价膀胱灌注药物疗效方法的客观性、灵敏度、准确性及特异性均较差,不能有效反映药物的疗效,故探索出一种客观、特异、准确、灵敏的评价方法,具有重要的临床意义。 荧光成像技术可以直接、无创伤和快速地在活体动物体内实时成像,连续地观察药物治疗的疗效。香菇珊瑚红色荧光蛋白(discosomasp red fluorescent protein,DsRed)是Clontech公司商业化的一种低毒、低寡聚化的红色荧光蛋白突变体,广泛应用于生物医学的各个领域。 Ag85复合体是卡介苗(bacillus Calmette-Guerin vaccine, BCG)培养滤液中的主要分泌蛋白,由Ag85A、Ag85B和Ag85C组成,相对分子质量为30 000～32 000。Ag85复合体不仅可以刺激机体产生体液免疫,尚可激发较强的Th1 型细胞免疫。大量实验证明, Ag85A DNA疫苗及Ag85B DNA疫苗可以诱导机体强烈的Th1免疫应答和CTL的激活,产生大量IL-2和IFN-γ等细胞因子。然而研究发现编码Ag85C的DNA疫苗免疫动物无效。近年来,利用Ag85A及Ag85B DNA疫苗治疗膀胱肿瘤越来越受到关注,并通过测量一些免疫相关指标(如CD4+T细胞数量、CD4+/CD8+比值、IL-2、IFN-γ等)来评价这些疫苗的临床疗效,但上述免疫指标的变化,不一定能真实反映DNA疫苗的临床效果。本实验采用活体红色荧光成像技术,通过可视化图像分析DNA疫苗的治疗效果,以期探索出一种客观、特异、准确、灵敏的评价新方法。 1 材料和方法 1.1 质粒、材料和仪器 含pVAX1-Ag85A质粒以及含pVAX1-Ag85B质粒的细菌由上海海规制备有限公司提供,质粒抽提试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。用质粒大量提取试剂盒分别从含相应质粒的细菌中提取pVAX1-Ag85A及pVAX1-Ag85B质粒。小鼠膀胱肿瘤细胞株BTT由上海交通大学附属第一医院细胞室提供。DsRed基因购于Clontech公司;DsRed表达载体由中国医学科学院实验动物研究所实验室构建。615小鼠(24只,6～8周龄,雌雄各半,体重18～22g)由中国医学科学院天津肿瘤医院肿瘤研究所提供[合格证号:SCXR(津)2004-0001],饲养于SPF级环境中。MAESTRO 8.5活体成像仪购自Maestro公司,荧光显微镜购自Olympus公司,PCR仪购自Gene公司,DU640核酸分析仪购自Beckman公司。G418购自Amresco公司。 1.2 bt细胞的表达培养 将BTT细胞接种于6孔板,于37 ℃、5%CO2培养箱培养过夜。转染当天,细胞融汇达50%～70%。转染方法按脂质体2000试剂盒操作说明进行,转染后BTT细胞用胰酶消化后,转至100 mm 的细胞培养皿中,用含800 μg/ml G418的RPMI 1640培养基筛选细胞,每隔3～5 d换液,获得稳定表达DsRed的细胞(BTT-DsRed),挑取单克隆,用含10%胎牛血清及0.05% G418的RPMI 1640培养基扩大培养。常规胰酶消化后计数BTT及BTT-DsRed细胞,绘制细胞生长曲线。 1.3 btt-ss水生植物 0.25%胰酶消化对数生长期BTT-DsRed细胞,调整细胞密度为2×107/ml。取24只615小鼠,右后肢大腿内侧皮下注射0.2 ml BTT-DsRed细胞悬液(约4×106个细胞),3 d后在左后肢大腿内侧皮下注射BTT-DsRed细胞悬液0.2 ml,制备BTT-DsRed膀胱癌移植瘤小鼠模型。 1.4 g65b疫苗 将24只615膀胱癌BTT-DsRed细胞移植瘤小鼠随机分为3组,分别为:pVAX1-Ag85A疫苗治疗组、pVAX1-Ag85B疫苗治疗组和生理盐水组。各组分别于右后肢肿瘤细胞接种后的第6、13、20天,于右后肢肌内注射相应质粒DNA疫苗:pVAX1-Ag85A 0.1 ml(100 μg)、pVAX1-Ag85B 0.1 ml(100 μg)、生理盐水0.1 ml。然后各组分别于右后肢DNA疫苗治疗后的第0～3周,用活体荧光成像系统拍照,MAESTRO 8.5图像分析系统进行分析。 1.5 淋巴结组织的消化 DNA疫苗治疗后的第3周处死小鼠,分离肝、肺、肾和腹腔淋巴结组织,将新鲜的组织剪成约1 mm3小块,置于0.125%的胰酶中,37 ℃消化5 min。然后,将小块的组织放在干净的载玻片上,用盖玻片压片后,荧光显微镜下观察。 1.