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全脑内细胞外信号调节蛋白激酶基因perk12的表达 丝裂原激活蛋白激酶（mk）家族是一项重要的内信号通道，用于调节和控制各种重要的细胞因素的生长、分化和死亡。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2是其家族的成员之一。该激酶被上游蛋白磷酸化后成为活化形式,进一步作用于胞浆内多种信号分子或细胞骨架蛋白,并可直接进入核内通过作用于转录因子,调控基因表达。在神经科学研究中发现,非磷酸化的ERK1/2在正常大鼠脑内广泛分布。由于ERK1/2分子在受刺激后可迅速磷酸化,因而目前许多研究中已将其作为一种神经元功能活动的标志物而广泛应用。但是,在未受刺激的正常动物脑内就有ERK磷酸化的现象,提示ERK参与一些脑的正常功能或代谢。因而,研究正常状态下磷酸化ERK1/2在脑内的分布,可以为研究ERK可能参与脑的哪些正常活动提供线索。既往我们曾报道了正常大鼠脑内磷酸化ERK1/2的分布,本研究中我们报道其在另一种常用实验动物小鼠脑内的分布,并对其与大鼠分布上存在差别的可能原因进行了分析。 材料和方法 1. 用1%多聚甲醛灌流法 正常雄性BALB/c小鼠6只,8周龄左右。动物购回后在新环境中适应1周,以消除新奇环境可能造成的心理应激。仔细确定拟施行脱臼的颈椎部位,迅速脱臼处死,经检测动物已完全没有意识且反射消失后即经心脏灌流,先用20 ml生理盐水快速灌流冲洗血液, 然后用预冷的4% 多聚甲醛50 ml快速灌流,继以慢灌100 ml。灌注完毕取脑,用4% 多聚甲醛固定液后固定6 h,放入20% 蔗糖溶液进行冰冻保护,置 4℃冰箱。待组织完全沉底后,用冰冻切片机连续切片,片厚40 μm。-20℃冻存液中保存备用。 2. 不同浓度的羊抗兔血清中pahs的表达 从-20℃冰箱取出切片(1/5脑片, 隔5张取1张),0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3次后,浸入含甲醇(800 ml/L)和双氧水(3 ml/L)的封闭液中处理30 min,以清除内源性过氧化物酶,然后用0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3次;再用含10 g/L 牛血清白蛋白、30 ml/L 正常羊血清和3 ml/L Triton X-100的封闭液处理1 h,以封闭抗体的非特异性结合,用0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3次。ABC 方法如下:兔抗小鼠磷酸化ERK1/2抗体 (1∶1000, NEB) 孵育切片24 h(室温),0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;生物素化的羊抗兔IgG (1∶500, Sigma) 孵育切片,室温下6 h,0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC, 1∶500, Vector) 孵育切片2 h(室温),0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;硫酸镍胺加强DAB 蓝色反应法呈色。当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应。经脱水、透明和封片后,在光镜下观察、计数和摄片。取部分切片用做免疫组织化学方法对照实验,一抗用牛血清白蛋白稀释液替代,二抗、ABC 复合物同其他免疫组织化学反应切片,结果未见阳性结构。 海马的阳性细胞 pERK1/2样免疫反应阳性产物在正常小鼠脑内分布广泛。阳性产物主要见于神经元,定位于胞浆、胞核、树突(Fig.1A)以及白质中的部分神经纤维中。阳性神经元仅分布于一些特定的核团和结构,为了便于查阅和比较,我们根据Franklin和Paxinos以及Swanson的图谱,选取代表性平面作了一个pERK1/2免疫反应阳性神经元分布模式图(Fig.2)。下面就其在各脑区的分布特点作一简要描述。 在前脑皮质,pERK1/2免疫反应产物在岛皮质、边缘前皮质、扣带前皮质和视、听皮质有强表达,感觉运动皮质次之、压后皮质几无;阳性细胞主要局限于皮质浅层, 以Ⅱ层为主,但在边缘皮质深层亦较多(Fig.1F,G, Fig.2A-J)。 在海马结构, 海马水平部仅有少量散在的pERK1/2阳性锥体细胞,但在其垂直部阳性锥体细胞数量很多,集中于CA1、CA2、CA3及齿状回,并且可见海马伞的白质纤维呈中等强度染色(Fig.1C, Fig.2E-I)。杏仁核簇中以内侧杏仁核(Fig.1E)、皮质杏仁核、外侧杏仁核和基底外侧核较多,杏仁中央核仅在囊部偶见(Fig.2E-I)。隔外侧核的背部、腹侧部和隔海马核有中等量细胞呈pERK1/2免疫反应阳性(Fig.2B,C)。基底节的有关结构中除尾壳核的纹体基和靠近侧脑室的内侧周边偶见阳性细胞外, 苍白球、无名质和脚内核等均未见阳性细胞。间脑内出现阳性细胞的核团较少。丘脑室旁核前部、下丘脑背内侧核、弓状核(Fig.1B)及乳头体上核中阳性细