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基于家系的家系wdr-aq-fop多态性与侵袭性牙周炎的关联研究 所谓牙周炎，是一种与慢性牙周炎显著不同的牙周炎。临床表现为早牙、早牙、早叶牙，具有一定的家族聚集能力。病因包括复杂的外源因素(微生物因素与环境因素等)和遗传因素。流行病学研究显示,人群中不同个体的易感性有很大差异, 这种差异可能主要是由遗传因素决定的。目前已发现人类多个基因序列的多态性同牙周炎的易感性和牙周组织破坏程度相关,其中维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)是1,25(OH)2D3发挥生物学效应的核内生物大分子,其本质是一种调控细胞内基因表达的转录因子。VDR广泛分布于体内各组织细胞中,参与骨代谢和免疫炎症反应。一些研究表明,1,25(OH)2D3及其受体VDR的基因多态性不仅与骨关节疾病有关,而且与牙周炎关系密切。学者们发现,与骨代谢有关的VDR基因多态性位点有4个,分别为BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ。近年来,国内外学者对这些位点的多态性与牙周炎易感性的关系进行了研究,但结果不一,可能与样本量、疾病表型定义、种族差异、环境暴露以及人群分层等因素有关。家系研究可以较好地避免人群分层等因素的影响,被用于多因素疾病的研究中。本课题组以往的研究结果表明,VDR TaqⅠ和FokⅠ位点的单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms, SNP)可能与中国AgP患者的易感性有关,但这种关联性有待于在家系人群中得到证实。本研究拟用家系研究的方法对AgP患者及其亲属VDR TaqⅠ和FokⅠ位点的多态性与AgP的易感性进行关联分析。 1 数据和方法 1.1 agp的诊断 以2001年7月至2009年6月间在北京大学口腔医院牙周科门诊确诊的93例AgP先证者及先证者引荐法(proband initiated enrollment)纳入的155例一级亲属作为研究对象。本研究已通过北京大学生物医学伦理委员会的批准,所有研究对象均签署知情同意书。 AgP的确诊参照1999年国际牙周病分类研讨会所制定的标准,纳入条件包括:年龄小于36岁;快速的牙槽骨破坏和附着丧失;全口至少有2颗牙(其中一颗为第一磨牙)的探诊深度≥5 mm,邻面附着丧失≥3 mm,每名患者均拍摄全口根尖片证实有邻面牙槽骨吸收;患者除患牙周炎外,全身健康,无糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系统性疾病,女性未怀孕或哺乳。亲属的诊断参照1999年牙周病分类法和现状与回顾性相结合( the current and retrospective diagnosis and reported case history)的评分标准对其牙周破坏状况作出评估诊断,即利用现有临床证据(包括全口根尖片、全口牙周检查大表),并结合其口腔既往诊疗记录或牙周疾病史对是否患有AgP的可能性进行评分后做出评估。根据其可以诊断为AgP可靠程度的不同,定义为确定、较确定和可能3种诊断类型。由于可能型患者患病的证据相对较少,故在本研究中将可能型患者归为非AgP。 1.2 引物和病毒的合成 小量外周血基因组DNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)、PCR反应相关试剂(包括TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、2 000 bp DNA marker,均来自TaKaRa宝生物工程有限公司)、限制性内切酶(TaKaRa宝生物工程有限公司)。用于扩增VDR基因的引物由北京奥科生物技术有限公司合成,TaqⅠ序列为:Fw 5′ CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG 3′,Rv 5′ GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC 3′;FokⅠ 序列为:Fw 5′AGCTGGCCCTGGCACTGACT CTGGCTCT 3′,Rv 5′ ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC 3′。 1.3 方法 1.3.1 保存管理表1图4 采取外周静脉血1 mL,加入含EDTA的抗凝管中,4 ℃保存。采用上述DNA提取试剂盒提取外周血总基因组DNA,测定浓度和纯度,D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之间,-20 ℃保存。 1.3.2 热反应taq和f滨水重性小体制备聚合式 总反应体系25 μL,其中含模板DNA 2 ng,引物各10 nmol,Taq DNA聚合酶1 u,dNTPs各5 nmol及相应PCR缓冲液,无菌去离子水补足总体积。TaqⅠ反应条件为:95 ℃预变性10 min后,进行35次循环,循环条件为:95 ℃变性30 s,65 ℃复性30 s,72 ℃延伸60 s;最后72 ℃延伸7 min,扩增得745 bp的产物。FokⅠ反应条件为:95 ℃预变性10 min后,进行35次循环,循环条件为:95 ℃变性30 s,65 ℃复性30