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家族性hd家系中cagn基因的异常扩增 慢性进展性舞蹈，即亨特顿舞蹈，是一种常染色体遗传疾病。临床表现为舞蹈样的不随意行为、跳舞智力的下降和瘫痪。患者一般在中年发病, 发病前临床上难以诊断。HD的相关基因IT15定位于4p16.3, 基因中5′?端 (CAG) n重复序列的异常扩增是导致该病发生的主要原因。正常人的重复拷贝数在6 37之间, 患者突变基因的 (CAG) n拷贝数明显增加。通过在分子水平上检测 (CAG) n片段的长度, 可进行基因诊断。我们应用巢式PCR及琼脂糖凝胶电泳技术对一个HD家系中的11个高风险成员进行了基因诊断。 数据和方法 1. hd家庭系统 一个家族性HD家系 (图1) 由本院遗传咨询门诊提供。 2. dns模式 来自该家系中的先证者及10例HD症前高风险成员, 按常规方法提取外周血白细胞DNA。 3. 引物筛选及其扩增效率 参照文献由中国科学院微生物所合成PCR引物, 为避免 (CAG) n下游多态性 (CCG) n重复序列对实验结果的干扰及提高扩增效率, 选择引物HD1、HD3、HD482, 其序列如下: HD1:5′?ATG AAG GCC TTC GAG TCC CTC AAG TCC TTC 3′ HD3:5′?GGC GGT GGC GGC TGT TGC TGC TGC TGC TGC 3′ HD482:5′?GGC TGA GGA AGC TGA GGA G 3′ 4. pcr扩增聚合酶 分两步进行 第一步:采用外侧引物HD1、HD482, 25μl PCR反应体系, 模板50 100ng, 每种引物0.5μmol/L, dNTP 250μmol/L (其中, dGTP:Fdeaza?dGTP的浓度为1:1) , 10×缓冲液, 首先95℃变性5分钟, 75℃时加入2U TagDNA聚合酶, 然后进入循环94℃1分钟, 62℃1分钟, 72℃1分钟, 循环25次后于72℃延伸10分钟。 第二步:取扩增产物3μl进行第二次PCR扩增。在25μl体系中含引物HD1及HD3各4μmol/L, 其余同前。PCR扩增条件94℃30秒, 65℃45秒, 72℃1分, 循环35次后于72℃再延伸10分钟。 5. 脂肪胶电泳 取扩增产物8μl在1.5%琼脂糖凝胶、1×TBE缓冲液、5V/cm电压电泳, 紫外灯下观察结果。 it15基因pcr扩增 应用巢式PCR检测该家系成员11人, 电泳显示正常人具有一条扩增区带, 其片段大小约为120 bp, 先证者中显示出两条IT15基因的扩增带, 其中一条与正常人相仿, 其大小约120 bp左右, 而另一条扩增片段约为200 bp, 另外两人显示先证者同样的带型, 为HD基因携带者 (图1中的Ⅲ4、Ⅲ8;图2中的4、8) 分子水平的检测 由于HD属常染色体显性遗传且中年以后发病, 通常患者在发病前已把自己的致病基因传给下一代。因此对HD高风险者进行症前及产前诊断具有极其重要的意义。 以前HD的基因诊断和产前诊断主要依靠用DNA标记进行连锁分析, 但由于互换的存在使诊断方法本身存在不精确性, 而且也需要其他家属成员的配合等原因, 使连锁分析法对HD症状前、早期诊断的应用受到限制。HD基因 (CAG)12序列超正常范围扩展作为HD发病的分子基础被揭示以后, 我们可以通过在分子水平上检测 (CAG) n的拷贝数, 进行该病的早期诊断和产前诊断。由于HD基因中 (CAG) n序列下游有一重复的 (CCG) n序列, 极易形成二级结构, 阻碍PCR中DNA变性和引物延伸, 使PCR扩增效率降低, 一般琼脂糖凝胶电泳难以检测, 以往常采用掺入同位素来提高检测灵敏性。我们在PCR反应体系中加入一定量的7 eaza?dGTP, 从而有效地防止了DNA二级结构的形成, 提高了PCR扩增效率, 在琼脂糖凝胶上便可直接检出HD患者, 简化了程序, 更便于临床上应用。 以往文献报道所采用的引物引导PCR扩增区域除包括IT15基因的 (CAG) n重复序列外, 还包括其下游的 (CCG) n重复序列, 故结果难以对 (CAG) n重复序列的拷贝数作准确评估。我们参考文献, 采用巢式PCR的技术路线使之只对CAG重复序列进行直接扩增, 避开了CAG重复序列下游的 (CCG) n串联重复区被扩增, 从而可对患者和正常人 (CAG) n重复进行准确评估, 提高了诊断的准确性。 我们的研究结果不仅为HD高风险者进行症前诊断提供了一个简便、快速的方法, 还为该家系中进一步作产前诊断的HD基因携带者奠定了基础。