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先天性小耳畸形家系遗传研究 先天性耳畸形是最常见的面部畸形，在嘴唇和下巴后也是最常见的面部畸形。先天性小耳畸形病因尚不明确,遗传是发病因素之一,家系是研究遗传因素的重要资源。我们于2005年9月~2007年3月,通过对中国医学科学院整形外科医院住院患者及其家属家族史的询问调查,收集了先天性小耳畸形家系7个,并进行了相关的遗传学研究。 1 材料和方法 1.1 家庭收集的东西 1.2 显染色体检测 1.2.1 rpmi133000酸、碱和环境质素的制备 取0.3ml肝素钠抗凝静脉全血接种于15%小牛血清、适量抗生素和PHA的RPMI1640培养基中,放37℃恒温箱中培养,至36h后加入终浓度为7.3×10-8mol/ml的秋水仙素,继续培养至48h。 1.2.2 气调和干燥组 用0.075mol/L的Kcl低渗处理两次,每次10min,3:1甲醇、冰醋酸固定,第1次10min,第2次15~20min,空气干燥制片。 1.2.3 胰酶解质剂为5%的diemsa染色 将制备出的标本放于37℃恒温箱中5~7天,然后用0.025%的胰酶37℃条件下处理15~20s,8%Giemsa常温下染色20min后镜检。 1.3 瑞典突变筛查 1.3.2 dna复合系的pcr扩增 vrk1基因设计引物覆盖了vrk1所有编码区和外显子和内含子交界处的的引物11对(外显子1为非编码区故未设计引物检测,见表1)。应用25μl的PCR反应体系,包含基因组DNA0.5μl,5U/μl Ampli Taq polymerase0.5μl,10x PCR缓冲液2.5μl,10mmol/L d NTPs1μl,primer0.5μl,双蒸去离子水补足致25μl。PCR反应条件如下:95℃预变性15min;94℃30s,60℃30s,72℃55s,10个循环;94℃30s,56℃30s,72℃45s,22个循环;72℃充分延伸5min;4℃保存。取2μl PCR扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。 1.3.3 na测序 PCR产物经纯化回收后,进行双向DNA测序,测序由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。将测序结果与基因库中的正常序列进行对比分析。 2 结果 2.2 染色试验 对7个家系的先证者(5男2女)经过染色体显带技术的检查,结果核型正常,为46XY或46XX,且未发现有染色体的异常。 3 身份证及其他基因型的定位和功能基因组织interpersonal 家系在遗传因素的研究中具有重要作用。目前业内普遍认为,找到某一复杂性状相似呈单基因遗传的家系,是克隆复杂性状的相关基因的最佳途径。正是如此,国内外学者以及国内外较高级别的研究资助机构普遍认同一个观点:找到大家系,即找到人类遗传的全部所在。疾病家系就是“基因资源”,成为各国保护和争夺的对象。我国是一个拥有丰富的先天性小耳畸形病种资源的大国,因此,保护、利用和研究我国宝贵的遗传家系是迫在眉睫的工作。 我们利用收集的家系进行了细胞遗传学和分子遗传学检测。绝大多数先天性小耳畸形的染色体核型检测是正常的,但少数患者出现染色体畸形,目前报道的包括:5p染色体缺失,6q单体性染色体,8q染色体缺失,18三体,21环状染色体,22q缺失,22三体,47XXY。除此以外,还有报道染色体镶嵌现象,包括7三体镶嵌,9三体镶嵌。我们针对收集的7个家系的先证者进行的染色体核型检测未发现核型和染色体的异常。 侯选基因(Candidate gene approach)结合基因定位的方法进行分子遗传学研究,是近几年随着人类疾病基因研究的进展而发展起来的一种基因鉴定的方法,是根据某种遗传病和特定基因分别定位于染色体的同一区域,而发现并鉴定其基因突变,由此定位和克隆基因;也可从疾病的表型出发,选取表型相似的己知基因,对其突变进行检测,研究其致病基因。如在分子遗传学研究中能够灵活运用候选基因法,可能会获得意想不到的成果。 Kelberman等收集了半侧颜面短小(hemifacial microsomia)家系,首次通过全基因组扫描、连锁分析的方法将其致病基因定位于14q21,位于微卫星标记物D14S987、D14S65之间约为10.7厘摩的区域。先天性小耳畸形可以看作半侧颜面短小的微小表现形式(microform),因此我们通过,查询微卫星标记物D14S987和D14S65之间的基因及其功能,共寻找到7个知名基因,通过对这些基因功能的分析,我们选择对细胞凋亡起重要调节作用的基因,并且在软组织、软骨和骨骼组织都有表达的基因作为候选基因,符合以上条件的基因首选vrk1(vaccinia related kinase 1)。但通过对于7个先天性小耳畸形家系先证者的基因检测,初步排除了vrk1基因突变。 微卫星标记物D14S987和D1