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水中孔雀石绿的同位素内标稀释与定性确证 氨基溶胶（mg）是一种合成三甲基甲基磺酸工业材料。它对高效光谱杀菌作用。经常用作杀菌和驱虫剂。在水产养殖中,渔民经常用它进行水体的消毒,杀灭寄生虫、预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等。在运输过程甚至市场、饭店销售时也有人将MG用作消毒剂,以延长鱼类的存活时间。MG及其代谢产物隐色孔雀石绿(Leucomalachite green, LMG)具有残留时间长、致癌、致畸、致突变等副作用,我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》,禁用于所有动物食品。但由于其价格低廉,特效替代药尚未发现,非法使用屡有发生,如2006年国内影响较大的多宝鱼、桂花鱼“染绿”事件。 MG对食品安全的影响已引起人们广泛关注,国家已出台了相应的标准检测方法GB 20361-2006、GB/T 19857-2005及农业部行业标准SC 3021-2004,其中GB20361-2006 和SC 3021-2004为高效液相色谱法,GB/T 19857-2005为液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS);作者也报道了同位素内标稀释LC-MS/MS 方法。然而,以上方法及其它研究报道都针对水产品的检测,样品处理着重点在如何消除鱼体中蛋白、脂肪等基质,常采用氧化铝柱与阳离子交换柱双柱分离净化,操作复杂繁琐。而在卫生监督工作中碰到饭店酒楼中查出“染绿”鱼,执法追究需要分清MG来源于养殖基地还是在运输或酒楼养殖时添加等责任问题,必须确定养殖水中是否含有MG,但水中MG的检验方法尚未见报道,因溯源中水的MG和LMG含量有可能很底,需要方法灵敏度高,定性可靠、定量准确,为此我们建立了水中MG和LMG的同位素内标稀释LC-MS/MS,方法简单,主要利用离子交换柱高度富集浓缩水中待测物,且高效、灵敏、特异性强,用于鱼池水和养鱼塘水中MG和LMG定量分析和定性确证,取得较好的效果,为进一步开展MG溯源调查的研究打下基础,为监督执法提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 仪器和试剂 1.1.1 气相色谱-质谱条件 1100 液相色谱仪(美国Agilent公司),API 3000串联三级四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司),配有Turbo-Ionspray源、针泵以及Analyst 1.4数据处理系统,气源为高纯氮气;色谱柱:Atlantis C18,2.1mm×150mm ×5.0μm(美国Waters公司)。Allegra 64R 高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);固相萃取柱(SPE):Agilent AccuBOND Ⅱ SCX,3ml, 500mg(美国Agilent公司);0.45μm有机系针筒式微孔滤膜过滤器。 1.1.2 试剂 二氯甲烷、甲醇、乙腈,均为色谱纯(Merck);冰醋酸;35%氨水;无水乙酸铵。实验所用试剂除已注明外均为分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 标准物质的配制 标准储备液(1mg/ml) 配制:准确称取(10.0±0.1)mg的MG、LMG、氘代孔雀石绿内标(d5-MG)、氘代隐色孔雀石绿内标(d6-LMG)分别置于4个10ml容量瓶中,用乙腈溶解各单标物质,并定容至刻度。 混合标准中间液:分别吸取适量MG和LMG储备液于容量瓶中,用乙腈逐级稀释至100ng/ml的混合标准。 混合内标中间液:吸取适量d5-MG和d6-LMG储备液于容量瓶中,用乙腈逐级稀释至100ng/ml的混合内标溶液。 以上标准溶液避光保存于4℃冰箱中。临用前用乙腈/水(50/50)稀释成适当浓度的标准系列,每毫升标准工作溶液中含有混合氘代同位素内标5ng。 1.2.2 宏观质谱条件 液相色谱条件:流动相为A:乙腈(含0.1%甲酸),B:2mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱:0～4min,5%～95%流动相A,4～12min,95%流动相A,12.1～16min,5%流动相A,流速:0.25ml/min; 进样20μl。 质谱条件:离子源为ESI(+),检测方式为多反应监测(Multiple Reaction Monitor, MRM)方式,利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果。质谱条件具体为:喷雾电压5500 V;离子源温度500℃;雾化气压力12psi;气帘气压力10psi;碰撞气流速5L/min;源内气11L/min;辅助气70 L/min;MRM参数见表1。 1.2.3 萃取小柱的制备 量取100ml 鱼池水样加入50μl 浓度为100ng/ml的混合内标,转移至事先用5ml乙酸/乙腈(5/95)溶液活化过的Agilent AccuBOND Ⅱ SCX固相萃取小柱上,以流速1～3ml/min过柱。待水样全部过完柱后依次用2.5ml丙酮,5ml 甲醇和5ml乙腈淋