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蓝萼甲素与血浆蛋白结合的研究 兰杯a素是属于唇科香茶菜科的一种成分。蓝萼甲素在体外具有抑制血小板聚集作用, 可以开发作为血小板聚集抑制剂。蓝萼甲素在10 mg/kg可显著增加86Ru的吸收, 提示具有改善微循环的作用。本课题组对蓝萼甲素在大鼠体内药动学过程进行了研究, 发现其分布和排泄较快。药物进入机体后能与体内多种生物高分子发生结合, 如药物与受体的结合、药物与核酸的结合等。药物与血浆蛋白的结合也是药物与生物高分子的一种结合, 与其他类型的结合之间存在一定的相关性, 因此药物与血浆蛋白的结合, 是药理学基础理论研究, 特别是分子药理学的重要研究内容之一。考虑到血浆蛋白结合对蓝萼甲素体内分布和排泄的影响, 本实验采用平衡透析法考察了蓝萼甲素在大鼠血中的蛋白结合率, 以便于进一步研究蓝萼甲素的代谢和排泄过程。 1 实验动物和动物 Agilent 110高效液相色谱仪:含四元高压泵、在线真空脱气机、柱温箱、20 μL手动进样阀;04/2—1离心机 (上海手术器械厂) ;吹气式浓缩干燥器 (汉邦科技有限公司) ;XW—80A涡旋混合器 (上海医科大学仪器厂) ;0.45 μm微孔滤膜 (安谱公司) ;FA2004N电子天平 (上海精密科学仪器有限公司) ;管状半透膜 (周长5 cm, 长10 cm, 上海西巴斯公司) 。蓝萼甲素 (HPLC峰面积归一化法测定其质量分数大于99%) 。内标物为8β-hydroxy-eremophil-7, 11-en-4, 6 (8, 12) -diolide (中国科学院药物研究所馈赠, HPLC峰面积归一化法测定其质量分数大于99%) 。SD大鼠, 体重220~250 g, 雌雄兼用, 由上海中医药大学实验动物中心提供, 动物许可证:SYXK (沪) 2002-00530。大鼠腹主动脉取血, 肝素抗凝, 离心 (3 000 r/min) 10 min, 分离血浆备用。 2 方法和结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 蓝瓶甲素对照溶液的制备 取蓝萼甲素10 mg, 精密称定, 置10 mL量瓶中, 加甲醇溶解, 稀释至刻度, 摇匀, 即得质量浓度为1 mg/mL的贮备液。 2.1.2 内标溶液配制 精密称取内标40 mg, 置100 mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密吸取上述储备液1 mL, 置10 mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 配成40 μg/mL的内标溶液。 2.1.3 磷酸盐缓冲液的制备 取磷酸二氢钠3.12 g, 氯化钠8.8 g, 加入1 mol/L氢氧化钠溶液适量, 调节pH值至7.4, 然后补水至1 000 mL, 即得0.02 mol/L磷酸盐缓冲液 (内含0.15 mol/L氯化钠) , 作透析液。 2.2 流动相柱温度 色谱柱:Hypersil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) ;流动相:甲醇-水 (45∶55) ;柱温:30 ℃;体积流量:1 mL/min;进样量:20 μL。见图1。 2.3 内标溶液、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、冰醋酸、活性饮料的制备 取大鼠血浆0.5 mL, 置10 mL具塞离心管中, 精密加入100 μ g/mL内标溶液10 μL、冰醋酸10 μL, 涡旋10 s, 精密加入乙醚3 mL, 涡旋3 min, 于3 000 r/min离心10 min。精密吸取有机相2 mL, 在60 ℃水浴中吹干。残渣加甲醇100 μL溶解, 过0.45 μm微孔滤膜, 即得。 2.4 线性关系研究 2.4.1 方法进样分析 精密吸取不同体积的蓝萼甲素对照品溶液适量于5个具塞离心管中, 以空白血浆配成含蓝萼甲素 0.2、 0.5、1、2、5、10 μg/mL的溶液。置10 mL具塞离心管中, 按2.3项下方法操作, 取20 μL进样分析。以蓝萼甲素峰面积与内标峰面积的比值对质量浓度进行线性回归, 得标准曲线方程Y=0.233 8X-0.017 44,r2=0.999 35, 线性范围为0.2~10 μg/mL。 2.4.2 方法进样分析 精密吸取不同体积的蓝萼甲素对照品溶液适量于5个具塞离心管中, 以pH 7.4的透析液配成含蓝萼甲素10、5、1、0.5、0.2 μg/mL的溶液。置10 mL具塞离心管中, 按2.3项下方法操作, 取20 μL进样分析。以蓝萼甲素峰面积与内标峰面积的比值对质量浓度进行线性回归, 得标准曲线方程Y=0.426 3X+0.076 3,r2=0.999 3, 线性范围为0.2~10 μg/mL。 2.5 药物从袋内外自由扩散目的对照的时间对照 除试验样本外, 另以2 mL透析液代替血浆, 以相同方法操作, 作为时间对照样本, 以确定药物从袋内外自由扩散达到平衡的时间。结果24 h袋内外溶液中蓝萼甲