肠型脂肪酸结合蛋白对大鼠肠缺血早期诊断的意义.docxVIP

肠型脂肪酸结合蛋白对大鼠肠缺血早期诊断的意义 以肠系膜上动脉（sma）阻滞为特征的急性肠缺血性疾病是临床急症腹痛最重要的疾病，具有较高的死亡率。 主要原因是在肠缺血发生不可逆损害之前缺少有效、可靠的诊断方法,以致诊断延误,导致肠坏死。本实验采用酶联免疫法对肠缺血大鼠血清中的小肠型脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid-binding protein,IFABP)进行测定,并与血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(creatine kinase,CK)及其同工酶BB(CK-BB)的含量进行比较,旨在探讨其对肠缺血性疾病早期诊断的价值。 1 材料和方法 1.1 小鼠肠间膜动脉分离 选取雄性SD大鼠48只,体重300～400g。术前禁食12h。腹腔内注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉后随机分组(n=6):(1)对照组。仅开腹,翻动小肠,测量小肠长度后关腹。(2)肠系膜上动脉结扎组(SMA 组)。开腹后,测量小肠长度,双重结扎肠系膜上动脉,保持肠系膜上静脉畅通。小肠缺血以小肠收缩、苍白及肠系膜动脉无波动为准。 每组动物在手术前及手术后1,2,4h分次分批于下腔静脉取血。离心3 000r/min,10min;分离血清,备检。处死动物,于距回盲部15cm处取少许肠组织,福尔马林溶液固定,石蜡包埋,切片,苏木精和伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,常规镜检。 1.2 微生物的制备 采用酶联免疫法测定。IFABP抗体由美国华盛顿大学医学院分子生物学实验室(Gordon, J. I. Department of Molecular Biology and Pharmacology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110.)提供。血清用PBS稀释10倍,在酶标板中每孔加入100μl血清样品;37℃孵育1h,用清洗缓冲液洗3次;10%羊血清37℃封闭1h,用清洗缓冲液洗3次;加入抗IFABP抗体37℃孵育1h,用清洗缓冲液洗3次后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体;37℃孵育1h,洗5次;加入底物室温避光显色15min,用2mol/L硫酸终止反应。吸光度值使用Bio-TEK公司EL340型酶标仪在492nm测定,对照样品,换算成量值。活性单位为ng/ml。 1.3 生化活性的测定 CK和LDH采用日本OLYMPUS Au1000型自动生化分析仪测定,试剂为澳斯邦(AusBio)生物工程有限公司产品(活性单位为U/L)。CK-BB测定采用乙酸薄膜电泳方法。 1.4 统计分析 所有计量资料均采用(xˉ±sxˉ±s)表示;数据应用统计软件包SPSS10.0进行方差分析和t检验,P0.05表示有统计学意义。 2 结果 2.1 小鼠肠道生长情况 对照组和SMA组动物体重依次为(18.0 ±3.5)g和(18.2±4.4)g,小肠长度为(320±48)mm和(330±46)mm,两组动物的两项指标值相近(P0.05),存活均超过4h。观察和采血过程中动物无死亡,动脉结扎线无松脱。死后尸检见SMA组绞窄肠段颜色较深,随肠缺血时间延长,腹液量渐多,未见明显肠穿孔及破裂。 2.2 血清ifabp的测定 对照组血清IFABP水平在各时点均无显著变化(P0.05)。SMA组血清 IFABP水平于结扎后1h迅速增加,结扎2h达到高峰。与对照组相比,IFABP活性升高在肠缺血1h差异即具有显著性(P0.01)(表1)。 2.3 活检时间的影响 两组动物血清CK,CK-BB及LDH活性均随缺血时间的延长而出现升高趋势,与对照组相比,各组分别出现显著性升高的时间为缺血后4,2,4h(P0.05)(表2～4)。 2.4 肠黏膜出血的形成 组织学切片见肠道黏膜的损伤程度随肠缺血时间的延长而加重, 1h即出现肠黏膜出血及局限性坏死,2h部分肠黏膜上皮脱落、坏死,4h肠腔黏膜全层坏死伴肠腔出血。 3 fabp的功能 急性小肠缺血性疾病是一种严重的外科急症。其绞窄性肠梗阻的病死率达4.5%～37.0%,急性肠系膜动脉栓塞的病死率近50年未发生变化,为70%～90%。对于急性小肠缺血性疾病,传统上常依赖典型的临床症状、体征及影像学进行诊断,一旦确诊,病情多已进入晚期。近十几年来,本病在诊断方面虽有所进展,如放射性核素、荧光素法、内脏血管造影术、Tonoinetry及Doppler超声等的应用,但这些方法仍不能达到早期快速、准确、简便诊断的要求,探讨早期、特异、有效的肠缺血诊断的方法一直是学者们重视的课题,而血清学指标的检测因其无损伤且准确快速更是得到更多的关注。 FABP是哺乳动物组织细胞胞液中的一组低分子质量(12～15 kD)的蛋白质,主要存在于能够