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乐胃饮对脾虚型ibs兔胃肠激素及氧自由基的影响 肠易激综合征（ibs）是临床上最常见的胃肠功能不全疾病。它显示了一组特定的病例，包括腹痛、腹胀、排便习惯、大便性质异常、舌苔、持续或间歇性发作，以及缺乏特定的教育学和生化学改变。乐胃饮是治疗腹泻型IBS的经验方,由淮山药、薏苡仁、陈皮组成,主要针对脾虚为本的病机特点,临床疗效满意。本研究主要从乐胃饮调节脾虚型IBS兔胃肠激素及氧自由基异常表达的角度来探讨中药复方乐胃饮治疗IBS的疗效和作用机制。 1 药物、实验方法及检测方法 1.1实验动物与分组 两月龄白毛黑眼兔(WHBE兔)36只,雌雄各半,体重约1.5kg,由上虞市星火兔业养殖场提供,实验动物许可证:SCXK(浙)2005-0022。将其随机分为6组:正常组、模型组、香砂六君丸组、丽珠肠乐组、乐胃饮低剂量组、乐胃饮高剂量组,每组6只,雌雄各半。 1.2主要试剂 一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、过氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,批号均兔抗SP抗体(一抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:Lot:L0106;免疫组化SP法试剂盒:购自北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:进口正常山羊血清工作液:购自北京中杉金桥生物技术有限公司,批号DAB试剂盒:购自北京中杉金桥生物技术有限公司,批号 1.3实验仪器 STP120型旋转式组织处理机、AP280-2 型石蜡包埋机、HM 335E 轮转切片机均由MICROM公司生产;BT-815A半自动生化分析仪由上海三科仪器有限公司生产;Carl Zeiss Imaging Systems(蔡司图像分析系统)由Carl Zeiss公司生产。 1.4药物制备 番泻叶由浙江中医药大学第二门诊部提供,用前用90℃热水浸泡两遍,每遍30min,制成含生药量约0.1g/ml浸液。乐胃饮由怀山药、炒薏苡仁、陈皮组成,由浙江中医药大学药学制剂室制备成含生药量2g/ml的煎剂。香砂六君丸:杭州胡庆余堂药业有限公司生产,批号:051002,用前用水调成0.1g/ml混悬液。丽珠肠乐:丽珠集团丽珠制药厂生产,批号用前用水调成0.0076g/ml混悬液。 1.5造模 将实验兔预养3d,观察无异常情况后进入正式实验。在一空房间内,用电取暖器将室温加热并维持在39℃～40℃。同时,用电热锅将水煮沸,利用水蒸气加大空气湿度,以建立一湿热环境。每天早8点钟起,将除正常组外WHBE兔置于此湿热环境中4h,此期间不予饮水、饮食,湿热应激结束后予以饮水、饮食(予饮食量为正常组的1/2量),连续7d。从第7天起空腹灌服番泻叶浸剂(按30ml/kg标准灌胃),灌胃结束后予以饮水、饮食(均予足量饮食),连续7d。从灌番泻叶浸剂的第3天起,各用药组WHBE兔下午灌服相应药物(香砂六君丸组按1g/kg灌服香砂六君丸悬液,丽珠肠乐组按0.038g/kg灌服丽珠肠乐悬液,乐胃饮低剂量组按20g/kg、乐胃饮高剂量组按40g/kg分别灌服乐胃饮煎剂),进行预防性药物治疗,模型组予生理盐水灌胃。正常组不予处理,正常饲养。造模时间共14d。 1.6观察指标及检测方法 1.6.1一般情况 观察各组WHBE兔的精神、活动状态、皮毛色泽、反应灵敏性、肛周污秽情况、粪便、饮食、饮水量、体重、肛温。 1.6.2血清一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活力 处死各组WHBE兔之前,耳缘静脉取血2ml,置一次性塑料试管中,低温暂存,然后放入离心机以3000r/min离心10min,分离血清,保存于-20℃以下待测。采用南京建成生物工程研究所试剂盒,操作按说明书进行。 1.6.3结肠黏膜组织中P物质(SP)的表达 处死各组WHBE兔后,在距肛门2cm以上取肠组织一段,10%中性甲醛固定,石蜡包埋备用。采用免疫组化法测定结肠黏膜SP含量。免疫组化染色行SP法。应用图像分析软件Carl Zeiss Imaging Systems对结肠黏膜SP阳性面积、平均光密度、总光密度(IOD)进行定量分析。DAB显色呈棕黄色颗粒样着色者为染色阳性。 1.6.4血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力 处死各组WHBE兔之前,耳缘静脉取血2ml,置一次性塑料试管中,低温暂存,以3000r/min离心10min,分离血清,保存于-20℃以下待测。血清MDA含量测定采用TBA法。血清SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法。严格按照试剂盒说明书进行操作。 1.7统计学方法 采用SPSS15.0统计软件处理,计量资料结果以均数±标准差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,计量资料的多个样本均数比较采用单因素方差