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mcl-1基因的克隆及功能研究 死亡是基因编码的程序性细胞死亡的过程，在生物发育、预防和保持稳定性方面发挥着重要作用。细胞的凋亡受阻与肿瘤的发生密切相关。已发现多种基因编码的产物参与细胞凋亡的调控, 目前对细胞死亡调节因子Bcl-2 (B cell leukelia-2) 蛋白家族有较深入的研究, 髓细胞白血病基因-1 (myeloid cell leukemin-1, Mcl-1) 是Bcl-2家族基因中的抗凋亡因子, 在多种癌组织中呈高表达, 而在癌旁组织中呈低表达状态, 提示抑制Mcl-1基因的表达, 或者阻断调节Mcl-1基因表达的信号途径能有效地诱导细胞凋亡, 为临床肿瘤治疗提供了新的药物干预靶点。 一、 mcl-1基因的生物学特性和功能 1. 短拼接变质剂在相关mrna中的表达 Mcl-1基因定位于人染色体1q21, 并在肿瘤疾病及其癌前病变中有重叠或重排现象。Mcl-1基因编码的蛋白主要定位于细胞内膜系统, 尤其是线粒体膜。Mcl-1基因全长6 502 bp, 含3个外显子和2个内显子, 外显子1、2和3分别含791 bp、248 bp和116 bp。通过RT-PCR方法证实Mcl-1基因在转录过程中存在短拼接变异, 可转录生成两种mRNA。由3个外显子拼接而成的全长Mcl-1 mRNA长1 155 bp, 可翻译为Mcl-1L (Mcl-1 long) 活性蛋白, 含350个氨基酸, 该蛋白具有Bcl-2同源区域 (Bcl-2 homology domain, BH) BH1、BH2、BH3及C末端转膜区, 功能与Bcl-2蛋白相似, 抑制细胞凋亡。丢失外显子2仅由外显子1和3短拼接而成的短拼Mcl-1 mRNA含907 bp, 翻译为由271个氨基酸组成的Mcl-1S (Mcl-1 short) 蛋白, 与Mcl-1L蛋白相比, 其缺失BH1、BH2和C末端转膜区, 具有同Bcl-2家族中BH3亚系 (仅含同源结构区域BH3的蛋白) 相似的功能, 作为死亡配体, 促进细胞凋亡发生, 且在正常细胞中也具有内源性促凋亡活性。在酵母双杂交系统中发现, Mcl-1S不与Bcl-2其他促凋亡或抑凋亡成员相作用, 仅可与McL-1L聚合, 抑制Mcl-1L的抑凋亡作用。McL-1S可与同一基因的另一变异体聚合形成二聚体, 其促凋亡作用也可被MCl-1L抑凋亡作用所拮抗。 2. se/ssa-主5和mapk、pi-3k、pi-3k信号通路 研究表明, 不同的肿瘤细胞Mcl-1基因表达的调节及相关信号途径也不同。主要包括核内信号途径JAK/STAT (anus kinase/signal transducer and activator of transcription) 通路, MAPK ( mitogen activated protein kinase) 通路和胞浆内信号传递通路PI-3K (phosphatidylinositol 3-kinase) 信号途径。阻断信号途径可致细胞凋亡并能减低Mcl-1的表达, 提示可作为临床抗肿瘤治疗新的靶点。 3. 改善细胞的生存 Mcl-1是Bcl-2家族成员之一, 主要功能是维持线粒体膜稳定, 抑制细胞色素C的释放, 从而促进细胞的生存, 阻止细胞的凋亡。Mcl-1 的半衰期较短, 约40 min, 对细胞内外环境因素的变化能做出快速反应, 被认为是控制细胞凋亡的上游分子, 具有在包括细胞毒制剂作用等各种诱导细胞凋亡的条件下, 延长造血细胞的生存能力, 同时也是肿瘤细胞生存的关键因子。 二、 mcl-1与肿瘤 Mcl-1在多种肿瘤组织如白血病、宫颈癌、肝癌中均有过度表达, 提示, Mcl-1与肿瘤的发生密切相关。此外, Mcl-1与多发性骨髓瘤的复发、慢性淋巴细胞白血病和结肠癌肝转移的耐药有关。 1. mcl-1基因缺失对肝脏疾病的抑制作用 Fleischer等研究提示, Mcl-1在肝癌组织中呈过量表达状态, 采用磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂LY294002可迅速下调肝癌细胞内Mcl-1水平, 并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性, 提示Mcl-1与肝癌的发生和耐药有关, 并可能是肝癌基因治疗的靶目标。Sieghart 等采用反义技术抑制Mcl-1基因的表达可直接促进肝癌细胞的凋亡, 而敲除Mcl-1基因并不影响正常肝细胞的生长。由于敲除Mcl-1基因对正常肝细胞无明显影响, 因此, 利用RNA干扰技术抑制Mcl-1基因对肝癌治疗具有明显的肿瘤特异性, 李银鹏等通过将小发夹RNA插入表达载体中, 成功构建了3种小发夹RNA表达质粒, 并证实这3种质粒对肝癌细胞内的Mcl-1基因均有显著的抑制作用。通过在mRNA和蛋白水平上对这3种质粒做进一步比较, 筛选出了对Mcl-1基因抑制作