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基于elisa技术的特布他林残留检测方法的研究 廷维林是一种镇痛剂。作为饲料添加剂使用，可以提高猪的生产性能，提高料肉比例，提高猪的瘦肉率。近年来,使用兴奋剂类药物所引起的食品安全问题屡见不鲜,引起社会各界的强烈关注。然而,目前对该类药物的检测方法主要是气-质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)以及液-质联用(LC-MS)等仪器法,此类仪器主要集中在检验检疫部门,且普遍存在着仪器昂贵、操作复杂、前处理繁琐、便携性差等弊端,而我国目前的养殖与肉食加工业又具有布局分散、规模小等特点。因此,仪器检测法远远不能满足我国现阶段肉食品安全的监管需要,这为部分养殖者使用违禁药物提供了可乘之机。当前形势下,迫切需要建立一种准确、高效、便携的检测手段,以尽快弥补仪器法对于药物残留检测的不足。 酶联免疫吸附检测法(ELISA)是一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的快速检测技术,具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单等优点,而且不需要专业的操作者,对大型仪器的依赖性也较低,非常适合样品的一线批量检测。目前,采用该类方法进行的药残检测研究多集中在克伦特罗、莱克多巴胺等药物,而关于特布他林的相关研究报道较少。本研究利用自主合成的特布他林的人工抗原及相应抗体建立针对特布他林残留的间接竞争ELISA检测方法,以期为特布他林的快速检测产品的研发提供理论参考。 1 材料和方法 1.1 试验方法酶 猪肉市售;特布他林人工抗原、包被抗原以及抗体本课题组合成并保存;硫酸特布他林、硫酸沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸莱克多巴胺、肾上腺素等标准品中国药品生物制品鉴定所;卵清蛋白(OVA)美国Sigma公司;羊抗兔酶标抗体Ig G-HRP北京军事医学科学院;PBST:p H7.4、0.01mol/L、含体积分数0.5%Tween-20;封闭液:含体积分数1%OVA溶液的PBST;酶标记抗抗体;辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(Ig G-HRP),用时PBST 1000倍稀释;柠檬酸钠缓冲液:p H5.0、含0.1mol/L醋酸钠的柠檬酸溶液;显色液:10mg邻苯二胺、25m L柠檬酸钠缓冲液、5μL 30%过氧化氢,用时混合;终止液:2mol/L盐酸;甲醇、乙腈(色谱纯)德国默克公司;液相用水为自制超纯水;其他试剂为国产化学纯。 1.2 高效液相色谱仪 KHB ST-360酶标仪上海智华医学精密仪器有限公司;1100 Series型高效液相色谱仪(配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器)美国安捷伦科技公司;Sino Chrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×200mm,5μm)大连依利特公司;AG285分析天平瑞士梅特勒-托利多公司。 1.3 方法 1.3.1 抗体稀释度的测定 采用方阵法确定包被抗原和抗体的工作浓度,具体操作方式:用PBST将特布他林包被抗原稀释至20μg/m L,加入到96孔酶标板的A行各孔中,沿纵向作两倍稀释,使A→H行各孔中的包被抗原质量浓度依次为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/m L,100μL/孔,室温静置2h,PBST洗涤后拍干;加入封闭液250μL/孔,室温静置过夜,PBST洗涤后拍干;向第1列各孔中加入经PBST 500倍稀释的抗体溶液,沿酶标板横向作两倍稀释,使第1→11列各孔中抗体稀释度分别为1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8 0 00、1:1 6 0 00、1:3 20 0 0、1:6 4 0 00、1:1 2 8 00 0、1:256000、1:1024000,100μL/孔,第12列作为空白对照,加入PBST 100μL/孔;室温静置2h,PBST洗涤后拍干;再加酶标记抗抗体,室温静置1h,PBST洗涤后拍干;加入显色液进行显色10min,用终止液终止显色,测定各孔的OD492nm,筛选OD值略大于1的测试孔,以其所对应的抗原质量浓度与抗体稀释度为抗原和抗体的工作浓度。 1.3.2 《密度》特布他林第310 以1.3.1节所确定的包被抗原工作浓度重新包被96孔酶标板,封闭;向96孔酶标板的第1列各孔中加入100μL PBST,向第2→12列各孔中加入特布他林抗体(浓度为2倍于抗体工作浓度),50μL/孔;再向第3→12列各孔中依次加入特布他林标准品,质量浓度依次为2×1 0-4、2×1 0-3、0.0 2、0.2、2、2 0、2×1 02、2×1 03、2×104、2×105n g/m L,5 0μL/孔,混合均匀,使各孔的抗体最终浓度为抗体工作浓度,3→12列各孔中标准品质量浓度依次为1×10-4、1×10-3、0.0 1、0.1、1、20、1×102、1×103、1×104、1×105ng/m L;参照1.3.1节方法添加酶