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食用菌深层培养过程中菌丝体、菌丝体含量及代谢产物的检测 蘑菇的深层栽培是获得液体细菌、真菌和代谢产物的现代方法。为了更好地控制培养条件,达到优质高产的目的,需对发酵液中菌丝体含量、菌丝球数量及代谢过程中酸度、总糖及还原糖、氨基酸、粗多糖、溶氧系数等的变化,建立一定的检测方法。现将我们对香菇、平菇、金针菇、猴头菌等深层培养的多年实践所拟定的一套检测方法介绍于下。 菌丝体含量的测定 (一)沉降体积的测定将发酵液稀释一定倍数,取均匀混合样5ml于刻度离心管内,每分钟3000转离心10分钟,测量菌丝体体积。 (二)菌丝体干重的测定取不少于100ml发酵液,水洗至水相澄清。在砂芯漏斗上以已知60℃烘干重的滤纸真空抽滤,然后将菌丝体连同滤纸于60℃鼓风干燥2小时,迅速称重,精确至0.01g。 菌丝球数量及大小测定 (一)菌丝球数量的测定取不少于50ml的发酵液,按一定比例在带塞量筒中加水稀释,摇匀后取一定量在直径150mm的培养皿中摊匀,培养皿下垫黑白相间方格纸,用方格法计数。 (二)菌丝球大小的测定在培养皿中取30个以上菌球排成一列,测量总长度,精确至1mm。 注:①对于发酵液中菌球只占一定比例者,可先测得菌球占整个菌丝体的体积或重量百分数,再测其大小和数量。②菌球以球形或拟球形,直径1mm,肉眼可辨为度。 酸度的测定(氢氧化钠滴定法) (一)试剂①1%酚酞指示剂:1g酚酞溶于100ml60%乙醇。②中性蒸馏水。③0.1N氢氧化钠标准溶液:吸取贮备的饱和氢氧化钠溶液的上层清液5ml加入1升中性蒸馏水中。标定时准确至1/万g称取经110～120℃干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.6g溶于50ml蒸馏水中,加热至沸,加2～3滴酚酞指示剂,用配制的氢氧化钠溶液滴至粉红色30秒钟不褪为终点。重复3次。配制的氢氧化钠溶液的当量浓度N=G/(V×0.2042).式中:G为邻苯二甲酸氢钾重量(g);V为滴定的氢氧化钠溶液ml数。 (二)操作取发酵液上清液1～2ml于250ml三角瓶中,加中性蒸馏水50ml,沸水浴30分钟排除CO2,速冷至室温,加酚酞指示剂2滴,以氢氧化钠标准溶液滴定至微红色30秒钟不褪为终点。滴定ml数记为V。 (三)计算按下式进行计算 总糖和还原糖测定(改良裴林法) (一)试剂①裴林甲液:15g硫酸铜、0.05g次甲基兰溶于1升蒸馏水中。②裴林乙液:50g酒石酸钾钠、54g氢氧化钠、4g亚铁氰化钾溶于1升蒸馏水中。③0.1%葡萄糖标准溶液:1.00g经100～105℃烘干至恒重的分析纯葡萄糖溶于少量蒸馏水中,再加8ml浓盐酸,定容至1升。④6N氢氧化钠:120g氢氧化钠溶于蒸馏水,冷却后定容至500ml。⑤6N盐酸:1:1盐酸(V/V) 500ml。⑥0.6N盐酸。⑦0.6N氢氧化钠。⑧0.5%酚酞指示剂。⑨10%硫酸锌溶液。 (二)操作①总糖水解待测液的制备:吸取5ml发酵液于25ml容量瓶中(吸管外壁的发酵液用滤纸擦去),吸管内壁的发酵液洗入容量瓶中。可加少许酒精消泡,以蒸馏水定容。吸取0.5ml稀释液于500ml三角瓶中,加蒸馏水和6N盐酸各5ml,于沸水浴中水解半小时,冷却。加10ml10%硫酸锌(除去蛋白质),加3滴0.5%酚酞,以6N及0.6N氢氧化钠调溶液呈微红色。转移至50ml容量瓶,定容。过滤,滤液置干燥容器中待用。②还原糖待测液的制备:吸取发酵液稀释液10ml,每分钟3500转离心10分钟,取上清液5ml于50ml容量瓶中,加10ml10%硫酸锌、3滴0.5%酚酞,以0.6N氢氧化钠调至微红色,定容。过滤,取滤液待用。③总糖和还原糖测定:按下表在250ml三角瓶中加入各试剂。表中序号1、2为空白试验,实耗葡萄糖ml数记为A;序号3、4及5、6分别为还原糖及总糖测试,实耗葡萄糖ml数记为B。滴定时先作预备试验。在沸腾状态下以水蒸气封闭碱式滴定管口,以标准葡萄糖液滴至兰色刚消失,出现黄色为止。正式滴定时,先按预备所得的滴定数据少1～1.5ml的量加入标准葡萄糖液,加热至沸,以2秒1滴的速度滴定,近终点时以4～5秒1滴的速度至兰色刚好全部消失而出现黄色时止。整个滴定时间保持在1～3分钟内。若待测液中所加的葡萄糖液过量,则加热至沸时兰色消失,此时应酌减葡萄糖液的加入量,或增加待测液量,或稀释葡萄糖浓度。 (三)计算按下式进行计算 氨基酸态氮测定(甲醛法) (一)试剂①中性甲醛溶液:50ml36～37%甲醛加1ml0.1%酚酞,以0.2N氢氧化钠调至微红。随用随时检查。②0.1%酚酞指示剂。③0.010～0.100N氢氧化钠标准溶液。 (二)操作①吸取发酵液上清液2ml,加20ml蒸馏水和3滴0.1%酚酞,用氢氧化钠溶液调至微红,然后加入中性甲醛溶液5ml,摇匀,放置片刻,以标准氢氧化钠溶液(当量浓度记为N)滴至微红色终点