基于水稻农艺性状的pms3荧光标记的构建与定位.docxVIP

基于水稻农艺性状的pms3荧光标记的构建与定位 20世纪70年代初，在湖北省发现的光秃秃的水稻具有良好的生长条件下雄性无育的特点，在短期生育条件下可以恢复雄性正常繁殖的特征。因此，不仅可以在不同的水稻育种条件下“一个系”：在长日条件下，作为不育系的混合种子，在短日条件下作为自我繁殖，而且可以为研究植物间异质醇栽培的机制提供宝贵的生物学材料。 大量的研究表明, 以光敏核不育水稻农垦58(简称NK58S)为材料与大多数品种杂交, 后代表现两对基因的分离。 将农垦58S与正常农垦58(简称NK58)杂交, 后代表现一对基因的分离。 近年光敏核不育水稻的基因定位取得了很大的进展, 分别定位了位于第7和第12染色体上的光敏核不育基因pms1、pms3, 并确定了位于第12染色体上的pms3是引起NK58转变为NK58S 的突变位点。 由于光敏不育属于生态不育型, 育性受环境条件影响较大, 最好能有永久群体(如DH群体、 RIL等)供多年、 多点考查, 才能获得准确的表现型数据。 同时在大多数组合中光敏不育受两对隐性基因的控制, 两对基因的分离及背景的影响使得难以根据表现型准确判定pms3位点的基因型, 而在NK58S/NK58组合中又因为背景不分离而无法对pms3位点进行定位分析, 所以为了验证并精细定位pms3, 需构建pms3单基因分离而该区域分子标记多型性又较高的新群体。 遗传座位的等位基因的偏分离是较普遍的现象, 人们利用不同的群体发现水稻12条染色体上都存在有分子标记偏分离的区域, 并且大部分偏分离的区域与已知的配子体基因或不育基因相重叠, 因而认为这些区域的偏分离是这些配子体基因或不育基因引起的。 Yamagishi在一个籼×粳组合中发现1、 3、 7、 10、 11、 12染色体上的一些区域的RFLP标记发生了偏分离, 并进而确定了其中位于第1、 10染色体上的两个区域与花培能力有关。 本研究利用NK58S/1514的杂种进行花药培养获得一个DH群体, 同时根据分子标记分析选择理想的DH系与NK58S杂交构建pms3单基因分离的F2群体及F3家系, 考查了各群体的育性表现及分子标记在各群体中的分离, 多方验证光敏不育的遗传规律并利用F3家系对pms3基因进行了精细定位。 1 材料和方法 1.1 同一愈伤组织的叶绿素 1996年夏季从NK58S/1514杂种植株上选取小孢子处于单核靠边期为主的新鲜稻穗经低温预处理及消毒后, 按照何予卿等的培养方法进行花药培养及绿苗分化, 得到的绿苗经壮苗后移栽于海南大田, 自然加倍的株系分单株套袋自交收种子, 1997年在武汉正季种植, 将来自同一愈伤组织的材料种植在一起, 通过考查育性、 株高、 生育期及其它田间性状以及RFLP带型等多项指标判定来自同一愈伤组织的绿苗是否来自同一小孢子, 田间性状及室内分析全部一致的所有株系认为来源相同, 反之, 则认为来自不同的小孢子。 1996年花培共得到288丛绿苗(来自同一愈伤组织的为一丛), 最后成苗161丛。 其中染色体加倍的有86丛, 无加倍单株75丛。 结合田间性状考查及室内分子标记分析判定我们共得到一个含79个DH系的DH群体。 1.2 生长曲线分析 在DH群体中, 选取育性正常、 第12染色体pms3区域是1514基因型、 第7染色体pms1区域是NK58S基因型、 其它染色体NK58S基因型背景较多的株系DH80与NK58S杂交构建F2群体, 1998年正季在武汉考查各单株在长日条件下的育性, 冬季移至海南考查短日条件下的育性并套袋自交收种子, 于1999年夏季在武汉种植F3家系, 每个家系种植20个单株, 秋季考查各株系的育性分离情况。 1.3 教育评估 DH群体及F2群体的每个单株随机收取3个稻穗考查其结实率, 同时对DH群体及F3家系在田间目测其育性及是否有育性分离。 1.4 酶抑制剂的筛选及分子杂交分析 DH群体及F2群体分单株收取叶片, 提取DNA, 每个样品取DNA 2.5 μg分别用BamHⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ及HindⅢ等五种限制内切酶消化。 DNA的抽提、 消化、 电泳、 转膜及分子杂交均按本室常规方法进行。 RFLP标记采用Mei等从306个RFLP探针中筛选到的分布于水稻12条染色体上的34个在亲本间有多型性的标记对DH群体及F2群体进行分析。 其中第1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 9染色体上都只有一个标记, 第10、 11染色体各有两个、 第7染色体上有4个、 第12染色体上有18个标记。 2 结果与分析 2.1 dh群体的生长 根据Mei等的研究, NK58S/1514组合中光敏不育受两对隐性基因的控制, 即位于第7染色体上的pms1和位于第12染色体上的pms3, 理论上该组合F