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荧光原位杂交技术在果树进化研究中的应用 在高等真核生物中，45srdna和5srdna是两种重要的编码糖苷钠（ribosmalna，rjra）的重复序列，其编码区域的可靠性和非编码区域的灵活性是研究动植物系统发育和进化的有用标志。如在细胞遗传学研究中,rDNA的数目以及分布的位置为核型分析提供了稳定识别个别染色体的有效标记。尤其对于染色体较小且形态特征不明显的物种,能提高同源染色体配对准确性,为进一步阐明染色体结构变异等重要的遗传学问题提供依据。此外,也常利用rDNA特定序列如ITS来研究植物种属间的进化关系,探讨多倍体物种的起源进化过程。正是基于上述rDNA的重要作用,我们参考国内外有关文献,拟对近几年45S和5S rD-NA在果树染色体上的比较定位以及ITS序列在果树特定类群系统进化中的应用研究进展进行综述,并指出其中存在的问题和未来的应用发展方向。 1 fps技术fps r DNA的物理定位常采用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术。目前,rD-NA已在重要的模式植物和经济作物的基因组中进行了广泛的物理定位。 1.1 扩大参与核仁形成的染色体 在植物中,45S rDNA为中度重复序列,是编码5.8S,18S,26S这3种rRNA的前体(图1),它主要定位于核仁组织区(Nucleolus Organizer Regions,NORs),参与核仁形成,一般在染色体的次缢痕部位(secondary constriction),与随体(satellite)相连。一般而言,核仁组织区的数目与随体数目一致,因此45S r DNA的杂交位点数目即为随体染色体的数目。5S r DNA也为重复序列,由编码区和非编码区组成(图2),它在染色体上的位置不像45S rDNA那样有与核仁相连的明显特征,而是随物种不同而不同。 1.2 srdna的染色体分布 近十年来,已经有较多的特别是属于蔷薇科、芸香科果树的45S和5S rDNA比较定位的研究报道(表1)。从表1可以看出,果树的45S rDNA常定位于1~4对染色体上,除分布在次缢痕及随体位置外,也常分布在染色体的短臂端部和着丝粒区,且位于随体之外的45S rDNA位点通常不具有转录活性,甚至有的物种中45S rDNA位点数目为奇数。以上这些定位特点表明,不同果树中45S rDNA位点的数目和在染色体上的位置有很大差异,表现出丰富的多态性。这种多态性可能与染色体重排、不等交换、非同源重组、基因颠换以及由转座子引起的隐蔽rDNA拷贝数的扩增、基因的休眠、转录失活和抑制等有关,也可能与45S rDNA分布在染色体端部有关,因为位于染色体端部的DNA更容易发生交换。从表1还可以看出,45S rDNA多位于短臂,这可能是某种分子和物理上的制约或作用使染色体短臂可以和核仁相连;但也有部分果树以及其他园艺植物的染色体由于臂间倒位或相继的45S rDNA重复片段在染色体上重排使得45S rDNA存在“反常分布”,如柠檬、枸橼、枳和日本早樱等的45S rD-NA位于染色体长臂中部或端部。 相对于45S rDNA的多态性主要集中在数量的改变,5S rDNA的多态性则主要倾向于分布位置的变化(表1)。果树的5S rDNA一般为1~3对,在染色体上的分布位置不固定。如柑橘属有2个5S rDNA位点,位于2条非同源染色体的长臂或短臂端部;扁核有2对位点,位于短臂近着丝粒处;砂梨有3对位点,位于长臂近着丝粒处;在番木瓜的粗线期染色体上竟检测到了13个5S rDNA位点,单条染色体具2~4个位点,信号强度各异。以上这些研究结果表明5S rDNA在染色体上的分布位置随物种不同而有较大差异,即具有较高的分布位置多态性。尽管如此,目前在果树中尚未发现5S rDNA定位于染色体随体或端粒的报道。 由于与45S rDNA位点有关的染色体发生易位,导致柑橘属、枳、日本早樱和西番莲等的45S和5S rDNA位于同一条染色体上。但一般地,可能由于功能上的分化导致它们之间需要存在一定的物理距离,使得45S和5S rDNA更加趋向于分布在不同的染色体上,并具有各自独特的进化模式。此外,还有一种现象是:除芭蕉属植物,45S rDNA位点数目通常多于或等于5S rDNA位点数目,出现这一现象的原因目前尚不清楚。 由于上述45S和5S rDNA在染色体上的定位特点,其在果树中的应用已不仅仅局限于识别染色体,也用于校正核型;此外,也对相同DNA序列进行比较定位,探讨基因组的进化。杨光绪等利用45S rDNA-FISH确定了砂梨有3对随体染色体,而不是传统核型分析的2对。Choi等应用rDNA-FISH发现部分柿属植物包括非洲4个种与亚洲7个种显著不同,推测它们具有不同的遗传基础。柠檬、来