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耐喹诺酮类大肠埃希菌的耐药机制研究 随着药物在临床上的应用越来越广泛，以及目前在中国的水产养殖中广泛使用的氧化二醇类抗剂，导致这种药物的抗剂率。 逐年攀升,对大肠埃希菌而言这种现象尤为突出。笔者将对其耐药机制进行研究。 1 材料和方法 1.1 研究对象及主要试剂 (1)菌株来源:大肠埃希菌266株,来源于2005年全年天津市第一中心医院就诊患者的痰、尿、血、便等标本,随机选取40株作为研究对象,其中37株对喹诺酮类抗菌药物耐药,3株对喹诺酮类抗菌药物敏感(包括1株对头孢类耐药菌株)。(2)标准菌株:大肠埃希菌ATCC 25922:天津市第一中心医院临床检验中心细菌室保存。(3)主要试剂和仪器:卫生部药品生物制品检定所提供药敏纸片。天津市金章科技发展有限公司提供细菌最低抑菌浓度(MIC)测定试剂盒。 1.2 菌株活性及检测 (1)菌种鉴定:实验用大肠埃希菌为2005年全年天津市第一中心医院临床分离菌株,从中筛选出38株耐药菌株,2株敏感菌株作为研究对象,并用法国生物梅里埃公司VITEK AMS60细菌鉴定仪的GNI+鉴定板进行菌种鉴定。(2)药物敏感试验:采用纸片扩散法(K-B法),测试菌株耐药性、微量稀释法测定抗菌药物体外最低抑菌浓度(MICS)。(3)基因组DNA的提取、纯化和检测:采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA,采用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。(4)聚合酶链反应(PCR)扩增:分别从GenBank数据库中获取的大肠埃希菌gyrA、parC及mar基因序列,按引物设计原则,分别设计1对包含大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药决定区在内的引物,并通过BLAST分析选取特异性较强的引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。(5)PCR-SSCP分析:制备1 7%聚丙烯酰胺凝胶后,加样及电泳,显色。(6)测序:选取耐药菌株的DNA扩增产物gyrA、parC和marOR基因进行测序。 2 药物敏感试验 2.1药敏试验 天津市第一中心医院2005年从住院患者中检出大肠埃希菌共计266例,其中116株来源于尿,99株来源于痰,35株来源于血,16株来源于引流液。通过MIC检测对环丙沙星耐药率为75.9%,MIC50和MIC90均为8 mg/L。 据NCCLS标准,对所选的40株大肠埃希菌进行的K-B法药敏结果显示,有38株菌对≥1种抗菌药物不同程度耐药,2株菌对试验中的所有药物敏感或中介。 2.2染色体DNA电泳 提取40株大肠埃希菌的基因组DNA,通过紫外分光光度计检测,所得基因组DNA的A260∶A280为1.8,浓度为0.5 μg/μl。 2.3PCR及PCR-SSCP 本实验对所有测试菌株gyrA、parC和marOR区域PCR扩增所得产物,经1.7%琼脂糖凝胶电泳检测均呈一条特异扩增带,且与预期片段长度相同。PCR-SSCP分析 对测试菌株gyrA基因片段的PCR-SSCP分析显示,对喹诺酮类抗菌药物敏感菌株ECO10、22、31的带型与标准株ATCC 25922带型一致,余37株大肠埃希菌的gyrA基因SSCP带型与ATCC 25922带型不同,呈现多态性,见图1。parC基因的PCR-SSCP分析显示,除3株喹诺酮类抗菌药物敏感株的SSCP带型与标准株ATCC 25922的带型相同外,对萘啶酸高度耐药的ECO24的SSCP带型也与ATCC 25922带型相同,余呈现多态性,见图2。 3 讨论 3.1 gyra基因突变 目前已知的耐药机制包括编码DNA消旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因突变,主动外排系统作用,菌膜对药物渗透性改变,多重耐药基因的突变及质粒介导的耐药机制。在众多的耐药机制中,以编码DNA消旋酶的gyrA基因和编码拓扑异构酶Ⅳ的parC基因突变最为基本和重要。本实验用PCR-SSCP法对40株大肠埃希菌gyrA和parC基因突变情况进行了检测,并通过测序确定耐药菌株gyrA和parC基因突变点。对40株大肠埃希菌gyrAQRDR区进行SSCP分析显示,敏感菌株ECO10、31、22的带型与标准株ATCC 25922带型一致,表示3株菌的gyrA基因未发生突变,余37株对萘啶酸耐药的大肠埃希菌gyrA基因SSCP带型均与ATCC 25922带型不同,说明发生了突变,可见,大肠埃希菌对氟喹诺酮类抗菌药物产生耐药与gyrA QRDR区发生基因突变存在必然联系。 选取耐药株ECO11和ECO24的gyrA QRDR区进行测序,其中耐药株ECO24仅对萘啶酸存在高水平耐药,对所选其他氟喹诺酮类及头孢类、氨基糖苷类药物均呈敏感或中介,若在该菌株中发现gyrA基因的突变,则更能说明gyrA基因突变,在大肠埃希菌产生喹诺酮类抗菌药物耐药机制中作用的基本性和重要性。与预期相符,两株菌株