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美洲黑杨种质资源库的遗传分析 物种资源的遗传评价是森林育种的重要组成部分。DNA分子标记的发展为遗传多样性的研究提供了新的手段,其中SSR标记作为共显性标记,具有多态性丰富、重复性高等特点,被认为是遗传多样性研究中最好的标记之一。目前,在我国利用SSR标记对林木进行遗传多样性的研究报道还很少。 美洲黑杨(Populus deltoides)是重要的造林用材树种之一,其天然林具有丰富的遗传变异,是杨树育种不可缺少的物质基础。自20世纪70年代引进美洲黑杨以来,杨树育种研究得到了迅速的发展,改变了我国杨树栽培的格局,但由于引进的无性系数量少,遗传基础较窄,从长远看不利于我国杨树产业化的发展。笔者以南京林业大学杨树研究和开发中心从美国密西西比沿岸采集的美洲黑杨半同胞家系建立的美洲黑杨种质资源库为研究对象,应用SSR标记对其中的11个半同胞家系的遗传变异进行研究,为杨树育种工作提供科学的理论依据。 1 材料和方法 1.1 补充实验的测定 材料来自江苏省泗洪县陈圩林场美洲黑杨种质资源库。种子采集于密西西比河沿岸流域(北纬30°～33°),其中11个美洲黑杨半同胞家系,共137个子代个体用于补充实验的测定(表1)。 1.2 ssr扩增 采用CTAB裂解-硅珠吸附法,从叶片中提取杨树总DNA。 SSR扩增中的引物来自美国西雅图华盛顿大学公布的杨树SSR引物(Poplar Molecular Genetics Cooperative,______ /PMGC/),共有132对引物用于分析(表2)。 SSR的扩增采用20 μL反应体系,包括:Tris-HCl (20 mmol/L pH 8.0)、KCl (50 mol/L)、明胶 (0.001%)、Mg2+(2.5 mmol/L)、dNTP (200 mmol/L)、正反引物(10 μmol/L)、Tag 酶(1 U)、DNA(50 ng)。扩增反应体系为:94℃预变性3 min;然后进入30个循环(94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 105 s);(72℃延伸10 min);4℃保存。扩增反应在美国PE公司产ABI9600型扩增仪上进行。扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳分析使用Bio-RAD PROTEAN Ⅱxi cell,银染检测结果。 1.3 upga聚类分析 SSR是共显性标记,银染后,用凝胶成像系统读取数据,以A、B、C…代表不同大小的等位基因。利用软件包POPGENE和TFPGA估算了等位基因数(N)、等位基因平均数(A)、有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)、遗传距离(D)、基因分化系数(Gst)等参数及等位基因频率,并做UPGMA聚类分析。 2 结果与分析 2.1 家系间的遗传多样性 试验中共筛选出12对SSR引物,对美洲黑杨种质资源库的11个半同胞家系的137份子代个体进行多态性位点的扩增结果见图1、表2、表3。由表2、表3可知,12对引物共得到了103个等位基因,平均每对引物得到8.67个等位基因;平均有效等位基因数为5.37。在所得到的103个等位基因中,有23个是一些家系所特有的稀有基因(占22%),其中11个为一个家系特有,有12个只分布于两个家系中,且这103个等位基因的频率分布极不均匀,有55个等位基因的频率低于0.1(占所有等位基因的54%)。平均观测杂合度(Ho)为0.39,平均期望杂合度(He)为0.75。其中,除了PMGC2408的有效等位基因数为0.37,PMGC2522的为0.5外,其余引物的有效等位基因数(Ne)均大于0.65。说明这11个家系具有极高的遗传多样性。从估算出的基因分化系数(Gst)来看,平均值为0.22,即在总的遗传变异中有22%的变异来自于家系之间,绝大部分存在于家系内。 各个家系遗传变异的比较情况见表4。从表4可以看出,各家系间的遗传多样性存在差异,但没有达到显著水平。各家系中,以95号家系的遗传变异最大,其等位基因数、有效等位基因数及基因多样度在所有家系中均最大(He=0.72),66号家系的遗传变异最小,其有效基因数和基因多样度均是最小的(He=0.55)。有效等位基因数(Ne),平均2.89,基因多样度(h)均达到了较高的变异水平。 2.2 基于亚类和亚类的家系聚类分析 根据103个多态性位点计算11个美洲黑杨半同胞家系之间的遗传相似系数,其范围在0.273 5～0.727 2,平均相似系数为0.481 4。根据Nei遗传距离,利用UMPGA方法进行聚类分析,获得聚类分析簇(图2)。从图2可以看出,取阈值为0.61,将11个家系分为两大类。第1类又分为两个亚类:63号和66号分为一类,81和86号为一类。第2类7个家系,分为3个亚类,89、102和103号家系一类,93