基于uplcorbirapms技术的黑疲定化法鉴定鲜蟾酥与干蟾酥的化学成分比较研究.docxVIP

基于uplcorbirapms技术的黑疲定化法鉴定鲜蟾酥与干蟾酥的化学成分比较研究

包包的味道又甜又热，味道很咸。这是中国传统的医疗材料。具有清热解毒、镇痛、强心等功能。临床抗肿瘤活性,疗效确切,且不良反应小。化学研究表明,蟾蜍毒素、蟾毒配基和蟾毒色胺类化合物是蟾酥的主要成分。不同炮制方法对其中蟾毒配基类成分的含量会有升高或降低的影响。近年来,鲜蟾酥的化学成分及其与干蟾酥的成分转化研究日益增多。研究显示,随放置时间延长,鲜蟾酥中蟾蜍毒素类成分会转化为相应的配基类成分,但鲜蟾酥与干蟾酥化学成分种类及含量的区别却鲜有报道。本文采用UPLC-OrbitrapMS高分辨液质联用技术将鲜蟾酥及干蟾酥对照药材的化学成分进行了对比研究,共检测发现了其中39种成分,通过与9种对照品比对分析,并结合化合物的精确分子量及其质谱碎片信息,对未知化合物进行了分子式的计算和部分化合物的结构推导,鉴定了其中35种成分,对于未鉴定出的化合物,本文列出了其精确分子量及可能的分子式组成,旨在阐明鲜蟾酥的组成及鲜、干蟾酥成分的区别,以提高药材利用度。

测定条件及方法

仪器与材料双压线性离子阱串联高分辨质谱OrbitrapVelosPro(ThermoFisher公司);戴安Ultimate3000超高效液相色谱仪;高速冷冻离心机(ThermoFisherHEREUSMULTIFUGEX1Rcentrifuge);0.22μm有机滤膜(津腾尼龙66,天津市津腾实验设备有限公司)。对照品:日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾毒精、华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精和酯蟾毒配基,购自北京赛百草科技有限公司,纯度均95%。供试品:蟾酥(购买于中国食品药品检定研究院,批号:121132-201304);鲜蟾酥(由北京房山阎村新生蟾蜍养殖中心提供),用于取耳后腺分泌物的蟾蜍经中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定为黑眶蟾蜍。

对照品溶液制备分别精密称取各对照品,加适量甲醇溶解后定容,配制成混合对照品溶液,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。

供试品取黑眶蟾蜍,用自制塑料刮瓶刮取蟾蜍耳后腺体得黑眶蟾蜍新鲜耳后腺分泌液,分别取干蟾酥及新鲜分泌液少量于小瓶中,加入含30%水的乙醇溶解,超声30min后,室温10000r转速下离心10min,取上清液经0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品。

色谱条件色谱柱为ThermoBDSHYPERSILC18(150mm×2.1mm,2.4μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脱程序:0~2min,5%~20%A;2~11min,20%~30%A;11~14min,30%~48%A;14~17min,48%~100%A;17~21min,100%A;流速:0.2mL·min-1;柱温:25℃;进样量:3μL;在线紫外检测波长扫描范围:190~400nm。样品盘温度:4℃。

质谱条件电喷雾离子源(ESI),扫描模式:正离子;毛细管喷雾电压:+5kV;毛细管温度:350℃;鞘气气流:35psi(1psi≈6.9kPa);辅助气流:10psi;扫描范围:m/z50~800;分辨率:30000。

检测方法取上述供试品及混合对照品溶液各1mL于液相小瓶,摇匀,注入LTQ-OrbitrapVelosPro液质联用仪进行测定。

数据分析根据测得的精确相对分子质量,应用ThermoXcalibur2.2SP1.48处理软件在规定的误差范围内(误差在±5ppm内)计算可能的元素组成,并结合各个成分峰的二级质谱碎片信息和文献报道数据及对照品比对,对色谱峰进行定性分析。

沙浚毒精的二级质谱

蟾酥中主要强心及抗肿瘤活性成分为蟾蜍二烯羟酸内酯和吲哚生物碱。结果显示,鲜、干蟾酥中生物碱类成分含量整体较低,配基类成分在鲜蟾酥中的含量较干蟾酥低,但在此色谱条件下,集中在保留时间为8~12min内的成分在鲜蟾酥中含量相对较高且集中,以下为对照品及未知化合物的推导过程。

蟾酥中游离型配基类成分的结构主要有环氧与羟基取代两种类型,高分辨质谱数据显示,所有对照品的一级质谱均出现[M+H]+(基峰)、[M+Na]+等主要峰,对照品的二级质谱一般出现脱去不同个数的水(18Da)和羰基(28Da)后的碎片和母核的碎片。沙蟾毒精为色谱中较早出峰的羟基取代型配基类成分,其一级质谱出现[M+H]+(C24H32O6,m/z417.22801,error:2.0ppm)峰及[M+Na]+(C24