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植物组织总rna提取的研究进展

植物组织总氮的提取是生物研究的基础。在对北位华侨基因的分析、基因外部翻译、cna文档的构建、cd-na末端的快速生长（race）和差异之后，需要对pcr（ddrtpcr）进行编码和其他研究。但植物组织RNA的提取较动物和微生物困难,原因是植物具有坚硬的细胞壁,同时富含多种次生代谢物,如多糖、多酚、蛋白质等。细胞破碎后,这些物质会以不同方式干扰RNA的提取,如酚类物质氧化后可使RNA活性丧失,多糖可形成难溶胶状物质与RNA一起被沉淀。另外,植物细胞破碎后,细胞内的RNA酶(RNase)以及操作体系中的RNase均会降解分离组分中的mRNA,且RNase极为稳定,在试验操作中很难将其彻底除去。因此,熟悉各种RNA提取方法的特点、了解提取过程中可能出现的问题并掌握解决疑难问题的对策是保证试验成功的重要一环。

1一些一般植物组织的rop提取方法和特点

1.1总rna的合成

通常采用异硫氢酸胍法或盐酸胍法提取植物总RNA。异硫氢酸胍和盐酸胍都是强烈的蛋白变性剂,不仅可强烈抑制Rnase的活性,还可有效解离核蛋白与核酸的复合体,与加入的巯基乙醇和N-月桂酰肌氨钠(Sarkosyl)共同对Rnase产生强列的抑制作用,使细胞破裂并迅速释放核酸,然后通过CsCl梯度密度离心或核酚法等方法去除DNA,得到总RNA。

该方法的优点在于有强烈的蛋白变性剂,能有效抑制植物材料及提取液中的Rnase活性,可用于提取大量植物材料的RNA。

1.2性沉淀rna

用高浓度尿素抑制Rnase并分离核蛋白与核酸,用LiCl选择性沉淀RNA。该方法操作简单、试剂价格低廉,但有时会存在DNA污染、丢失一些小分子量的RNA(如5SRNA)以及Li+和Cl-的残留等问题,所以可能会干扰mRNA的反转录和体外翻译。

1.3总核酸和总核酸分离

较高浓度的CTAB不仅对植物细胞有较好的裂解作用,而且还能有效分离核蛋白与核酸的复合物,同时和巯基乙醇共同作用使蛋白变性、抑制Rnase活性,使用无水乙醇或异丙醇沉淀总核酸,然后再选择性地分离出RNA。

1.4生物处理技术

该技术将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和氯化锂选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物、二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体,这几种物质都可抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合,通过Li+沉淀剩余的酚类物质,从而使其与RNA分开。因此,该技术非常适合于富含酚类物质的植物组织中总RNA的提取。改良热硼酸法不需要苯酚/氯仿/异戊醇法的抽提步骤,大大简化了RNA的提取过程。

1.5总rna提取

许多公司根据科研需要研制出一些提取RNA的试剂或试剂盒,可根据需要进行选择。以下为部分国外、国内试剂公司提供的植物组织总RNA提取试剂盒及其技术特点。

(1)Promega公司的PromegaSVTotalRNAIsolationSystem。其特点是快速、高效,用高浓度的亚硫氰胍稀释细胞,使Rnase失活,并沉淀蛋白,乙醇沉淀核酸,DNA酶消化残留的DNA,去除杂质,并将RNA吸附到硅化膜上,用DEPC-HO洗脱膜上的RNA即可。

(2)Viogene公司的totalRNAMiniprepSystem。其主要特点是产物中不含小分子RNA,获得的总RNA一般都大于200bp。

(3)Epicentre公司的EpicentreTechnologyMasterPureRNAPurificationgKit。其技术特点是利用快速拖延法去除污染的大分子物质,方法简单,用时短,可实现高通量、多样品的总RNA提取。

使用试剂盒提取植物材料总RNA的优点:①提取速度快;②提取试剂中一般含有抑制Rnase的活性成分,能较好的防止RNA降解,得到的RNA纯度一般较高。但也往往存在价格较高,一次提取植物材料量相对较少的缺点。

2rv提取中的常见病和对策

2.1去酚类物质、茶多酚和蛋白质的干扰

2.1.1酚类化合物

2.1.2沉淀多糖的制备

通过盐酸胍处理可以除去一些糖,通过LiCl沉淀也可以将部分多糖留在上清液中,也可用低浓度的乙醇来沉淀多糖。Fang等认为缓冲液中高浓度的NaCl或加入一定浓度的2-丁氧乙醇也有助于去除多糖。

2.2内源性nase污染

2.2.1受污染的金属地板、玻璃地板、塑料薄膜和电泳槽

2.2.2科学家的污染

2.2.3内源性污染来自植物

3不同组织的rna提取

植物组织总RNA的提取是构建cDNA文库、研究基因表达和调控以及进行基因克隆和遗传转化分析的基础,所得总RNA的质量直接影响到后续试验结果。所以对不同植物组织总RNA提取方法的改进一直是目前分子生