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内蒙古酸马奶中乳酸菌和酵母菌的筛选

酸马奶是在新鲜马奶的基础上由蘑菇和酵母菌共同发酵而成的。它具有独特的味道和丰富的营养价值。马奶经微生物发酵后,含有抑制传染性疾病如肺结核和非传染性疾病如胃肠炎的细菌素,具有很好的医疗保健作用。Marshall报道发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌之间可能存在相互作用,但其作用机制尚不是十分清楚。蛋白分解力强的酵母菌如Yarrowialipolytica和C.catenulata,分解蛋白释放的游离氨基酸如亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等,能够促进蛋白分解力弱的乳酸菌的生长。一些乳酸菌发酵乳糖的副产物为半乳糖,能够促进不发酵乳糖而利用半乳糖的酵母菌生长。乳酸菌代谢产生如苯乳酸、4-羟基-苯乳酸、环肽类物质会抑制酵母菌的生长,而溶脂酵母代谢产生的脂肪酸会抑制乳酸菌的生长。具有共生性乳酸菌和酵母菌所产生的特殊生物效价引起了研究者的广泛关注。Ishii等研究发现:Lactobacillusparacaseisubsp.Tolerans和Kluyveromycesmarxianusvar.lactis存在着共生关系,二者混合培养过程中富集的大量肽提高了培养液中的活菌数,促进乳酸的产生。Lactococcuslactis和Kluyveromycesmarxianus混合培养过程中酵母菌可以不断中和代谢产物中的乳酸,从而降低乳酸对乳酸菌生长的抑制,使得产物Nisin不断富集。本实验从内蒙古锡盟地区酸马奶中分离得到的乳酸菌和酵母菌中筛选相互作用较好的菌株,并研究其相互作用的生长特性,为进一步研究乳酸菌和酵母菌的共生提供参考。

1材料和方法

1.1培养基及微生物

内蒙古锡盟地区酸马奶中分离出的8株乳酸菌和7株酵母菌,乳酸菌编号分别为BL1、BL2、LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6,酵母菌编号分别为YE1、YE2、YE3、YE4、YE5、YE6、YE7。由内蒙古农业大学“酸马奶酒中抗菌因子的研究”课题组提供。

葡萄糖-酵母膏-蛋白胨(YEPD)液体及琼脂培养基按文献配制;MRS液体及琼脂培养基按文献配制;脱脂乳培养基:每100mL蒸馏水中加10g脱脂乳粉和0.1g酵母浸粉。

1.2大离心基生产设备

BCN-1360微生物洁净工作台、HZQ-X100振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;HIRAYAMA高压锅华粤企业集团有限公司;LG10-2.4A型大离心机北京京立离心机有限公司;HPS-250生化培养箱哈尔滨市东明医疗仪器厂;SK-1快速混匀器常州国华电器有限公司;T6新悦可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1酵母菌接种培养

将活化好的乳酸菌按体积分数2%分别接种在MRS液体培养基中,37℃恒温培养50h;将活化好的酵母菌按体积分数2%分别接种在YEPD液体培养基中,30℃恒温振荡培养70h。将培养液以4000×g离心20min,取上清液,并用0.45μm孔径的灭菌滤菌器进行过滤处理,即得到无菌代谢物,乳酸菌代谢物pH值调至5.5±0.2备用,酵母菌代谢物pH值调至6.5±0.2备用。

1.3.2乳酸菌代谢的检测

将制备好的酵母菌代谢物按体积分数30%加入到MRS液体培养基中,按照同样比例在MRS液体培养基中添加pH(6.5±0.2)的生理盐水作为对照,按体积分数2%接入乳酸菌,37℃恒温静止培养20h,振荡混匀后测其OD600nm值。与对照组比较,OD600nm值高于对照组且差异显著的为有促进作用,低于对照组且差异显著的为有抑制作用。

将制备好的乳酸菌代谢物按体积分数30%加入到YEPD液体培养基中,按照同样比例在YEPD液体培养基中添加pH(5.5±0.2)的生理盐水作为对照,按基础培养基体积的2%接入酵母菌,30℃恒温振荡培养30h,振荡混匀后测其OD600nm值。同理判断是否有促进作用。

1.3.3乳酸菌和酵母菌相互作用的测定

选取一组相互作用效果最好的乳酸菌和酵母菌进行共生特性的研究。在各自的培养基中添加对方的代谢物后进行发酵,以各自培养基中添加等量生理盐水后进行发酵作为对照,乳酸菌为37℃恒温静止培养,酵母菌为30℃恒温振荡培养,分别培养36h,每隔4h取样测定活菌数、pH值和滴定酸度,进一步研究二者的相互作用情况。

将乳酸菌和酵母菌按菌浓度比10:1混合接入脱脂乳培养基,先30℃恒温振荡培养12h后进行37℃恒温静止培养,在36h内,每隔4h取样测定乳酸菌活菌数,以37℃恒温静止培养的乳酸菌纯培养物中活菌数变化为对照,研究酵母菌代谢物对乳酸菌生长的影响。

将乳酸菌和酵母菌按菌浓度比10:1混合接入脱脂乳培养基,先37℃恒温静止培养8h后进行30℃恒温振荡培养,在36h内,每隔4h取样测定酵母菌活菌数,以30℃恒温