桔青霉素诱导鸡异嗜性粒细胞胞外诱捕网分子机制的初步研究.pdfVIP

摘要

桔青霉素（Citrinin，CTN）是常见污染玉米、小麦和大麦等饲料原料的真

菌毒素，饲喂动物后严重危害畜禽健康。有文献表明众多真菌毒素可引起机体

先天免疫细胞发生氧化损伤，引起先天免疫反应。胞外诱捕网（Extracellular

Traps，ETs）是一种新近发现的天然免疫机制，具有双重作用：在抵抗病原体

方面发挥着重要的作用，但过量时可对宿主自身造成损伤。ETs是由DNA和颗

粒蛋白构成的复合物，且被证实与活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）及

ROS激活的p38和ERK信号通路有关，此外，大量研究提示自噬可以调节ETs

的形成。在禽类也有类似功能的异嗜性粒细胞胞外诱捕网（Heterophil

extracellulartraps,HETs），而CTN在禽类能否诱导HETs目前尚无报道。因此，

本论文旨在对CTN能否诱导HETs及其分子机制进行探究。

首先，验证CTN能否诱导HETs：利用免疫荧光方法对CTN诱导的HETs

进行形态学观察，荧光显微镜下显示100μMCTN可诱导异嗜性粒细胞DNA与

组蛋白H3和弹性蛋白NE共定位，表明CTN可诱导HETs的释放。核酸定量试

验进一步检测HETs的释放情况，结果显示，50μM、100μM、200μM和400

μMCTN均可诱导HETs的释放，其中CTN在100μM时HETs释放量最大；且

CTN触发HETs的释放在0.5~2h呈时间依赖性增加，并在2h时HETs释放量最

高，表明100μM和2h为CTN触发HETs释放的最佳浓度和时间并作为CTN触

发HETs的最佳条件进行后续实验。

其次，阐明CTN诱导的HETs与ROS之间的关联性。使用相应的试剂盒检

测异嗜性粒细胞中抗氧化物质如SOD、GSH和CAT及脂质过氧化物产物MDA

含量，同时利用荧光探针检测细胞内ROS水平，结果显示，CTN显著抑制鸡异

嗜性粒细胞中SOD、GSH和CAT酶活力，此外，CTN显著增加了MDA含量，

并引起ROS增加，说明CTN抑制鸡异嗜性粒细胞抗氧化酶的活性，引起脂质过

氧化；westernblotting方法检测p38、ERK蛋白在细胞中的表达情况，结果显示

CTN激活异嗜性粒细胞的p38和ERK信号通路，这均提示ROS可能与CTN诱

导的HETs有关。进一步使用相关抑制剂SB202190（p38抑制剂）、U0126

（ERK抑制剂）和DPI（NADPH氧化酶抑制剂）探究其在HETs释放的作用，

结果显示，抑制p38、ERK信号通路和NADPH氧化酶途径未能阻断HETs的产

生，表明CTN触发HETs的释放不依赖于ROS相关的NADPH氧化酶、p38和

ERK信号通路。

最后，探究CTN诱导的HETs与自噬之间的关联性。通过免疫荧光技术检

测自噬标志物LC3B，可见CTN处理组中LC3B明显增多且LC3B与HETs-DNA

共定位，提示自噬与HETs存在一定的关系。荧光定量PCR检测鸡异嗜性粒细

胞中自噬相关调控因子的mRNA水平，结果显示CTN抑制自噬关键调节因子

mTOR及其相关通路ClassⅠPI3K和AKT的mRNA转录水平，同时激活负调控

mTOR的AMPK的mRNA水平，从而促进自噬的发生；CTN增加ULK1和

Beclin1的mRNA水平，指示自噬起始步骤的发生；CTN上调ATG5和LC3B的

mRNA水平，同时下调LC3A的mRNA水平并抑制p62的mRNA水平，指示自

噬延伸、自噬体形成及降解。进一步验证自噬在CTN诱导HETs释放过程的作

用，利用自噬激活剂和抑制剂检测HETs的释放水平，结果显示，自噬激活剂

rapamycin可显著增加HETs的释放，同时HETs的释放在自噬抑制剂wortmannin

和3-methyladenine组中均显著减少，表明CTN诱导鸡异嗜性粒细胞释放HETs

依赖于自噬，且自噬相关通路ClassⅠPI3K/AKT/mTOR信号通路及ClassⅢPI3K

参与了CTN诱导HE