Nogo-66受体作为阿尔茨海默病药物治疗新靶标的研究.pdfVIP

Nogo-66 受体作为阿尔茨海默病药物治疗新靶标的研究 摘 要 目的 研究 Nogo-66 受体（Nogo-66 receptor, NgR ）能否作为药物治疗阿尔茨海默 病（Alzheimer’s disease, AD ）的潜在靶标。此靶标是否具备促进皮质神经元突起 再生和抑制 β淀粉样蛋白（amyloid β-protein, Aβ）生成的双重作用。同时寻找具 备促进皮质神经元突起再生和抑制 Aβ生成双重作用的 AD 治疗药物。 方法 （1）体外无血清培养新生大鼠皮质神经元，采用神经元特异性烯醇化酶 （neuron-specificenolase, NSE ）和微管相关蛋白2 （microtubule-associated protein 2, MAP2 ）免疫化学染色法进行神经元鉴定；（2 ）采用不同细胞密度和不同浓度 的B27 培养大鼠皮质神经元，观察其对皮质神经元生长的影响；（3 ）体外培养大 鼠皮质神经元，加入不同浓度的Nogo-66 活性片段——Nogo-P4 ，用MTT法检测 不同浓度的Nogo-P4 （3.5μM 、7μM 、14μM ）对皮质神经元的毒性作用，通过细 胞形态学观察，突起生长状况的定量分析，观察Nogo-P4 对皮质神经元突起生长 的影响，应用ELISA （enzyme-linked immunoadsordent assay ） 法测定细胞分泌 的Aβ 含量，观察Nogo-P4 对皮质神经元Aβ 分泌的影响；（4 ）体外培养大鼠皮 42 42 质神经元，分别加入Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40 、受体下游信号分子ROCK （rho-associated coiled coil-containing protein kinase ）的抑制剂Y-27632 和PKC （protein kinase C, PKC ）抑制剂GÖ6976，采用上述指标，研究Nogo-P4 影响皮 质神经元突起生长和Aβ42分泌的机制；（5 ）采用Nogo-P4 制作细胞模型并进行药 物筛选，从中药单体中寻找有效化合物。 结果 （1）经两种不同的神经元特异性标志物 （NSE和MAP-2 ）鉴定，确定所培养 2 的细胞绝大多数为神经元；（2 ）合适的细胞密度（1200 个/mm ）和合适的B27 浓度（2%B27 ）有利于皮质神经元的生长，神经突起生长较长；（3 ）不同浓度的 Nogo-P4 对皮质神经元的存活率没有影响，不具有细胞毒作用。不同浓度的 Nogo-P4 能减少有突起细胞数量，明显降低神经元的平均突起长度，抑制皮质神 经元突起的再生，同时还能增加培养基中的Aβ 含量，促进皮质神经元分泌Aβ ， 42 42 I 并具有量效关系；（4 ）Nogo-66 受体拮抗剂NEP1-40 、PKC抑制剂GÖ6976 和ROCK 抑制剂Y-27632 对正常皮质神经元的突起生长和Aβ 的分泌无影响，对Nogo-P4 42 引起的皮质神经元突起再生抑制均有拮抗作用，能增加有突起细胞数量和神经元 平均突起长度，对Nogo-P4 引起的Aβ 生成有不同的影响。NEP1-40 能促进皮质 42 神经元突起再生，但不能减少Aβ42 的生成。GÖ6976 能促进皮质神经元突起再生， 同时增加Aβ 的生成。Y-27632 不仅能促进皮质神经元突起再生，同时也能减少 42 Aβ42 的生成；（5 ）经过药物筛选，找到一个有效单体SQ，能拮抗Nogo-P4 增加 有突起细胞数量和神经元平均突起长度，促进神经元突起的再生。但SQ不能减 少皮质神经元分泌Aβ42 。 结论