利用16S-23S rDNA间隔区快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种.pdfVIP

河北科技师范学院学报 第25卷第 1期，2011年3月 Jo啪 alofHebeiNormalUniversityofScienceTechnolo~ Vo1．25No．1March，2011 利用 16S一23SrDNA间隔区快速鉴定 猪链球菌和马链球菌兽疫亚种 刘广锦，陈绵绵，商可心，范 洁，张 炜，姚火春，陆承平 (南京农业大学动物医学院，江苏 南京，210095) 摘要：利用 16S-23SrDNA间隔区(ISR)长度和序列的多态性，结合 16SrDNA和23SrDNA的保守性，分别在 16SrDNA末端和23SrDNA前端保守区设计上下游引物，进行PCR扩增。结果为21株猪链球菌均扩增出长 度约为 1200bp的片段 ，8株马链球菌兽疫亚种均扩出约1300bp的片段，其他属菌株和阴性对照无结果。 因此，由PCR产物长度的不同就可快速区分猪链球菌和马链球菌兽疫亚种 ，这种基于ISR的PCR技术为鉴别 病原微生物提供了更加简捷的方式。对2株代表菌(HA9801，ATCC35246)的16S-23SrDNAISR进行测序发 现，猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的ISR差异主要表现为碱基的缺失。 关键词：猪链球菌 ；马链球菌兽疫亚种；16S-23SrDNA间隔区；聚合酶链式反应 中图分类号 ：S851．3 文献标志码：A 文章编号：1672-7983(2011)01-0009-07 猪链球菌病 (Porcinestreptococcaldisease)是由多种溶血性链球菌感染引起的猪的一种多型性病，包括急性型的败血 症和慢性型的关节炎、心内膜炎 、淋巴结脓肿、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等。通过流行病学调查，本病在我国各地均有发 生，猪链球菌与马链球菌兽疫亚种是我国猪源链球菌病的两种主要病原”J。猪链球菌(Streptococcussuis，S．suis)是1987 年由Kilpper—Balz等提议建立的1个新种 2J，能引起猪和其它家畜及人类的多种临床疾病，按照其荚膜抗原的差异，目前 分为35个血清型(1—34，1／2)和相当数量无法定型的菌株 j，其中猪链球菌1型、1／2型、2型(S．su／sserotype2，SS2)、7 型、9型属于在世界上流行较广的致病性血清型L3j，对养猪业及公共卫生均构成严重威胁。马链球菌兽疫亚种(Strepto一 equisubsp．zooepidemicus，S．zooepidemicus)属于兰氏分群的C群链球菌，其没有宿主专嗜性，可感染牛、猪、猴子和 羊 “，人类因食用污染的食物或与发病动物密切接触后，亦可引发该菌感染 ，是一种重要 的人兽共患病的病原。 1977年四川地区发生过该病的大流行，造成30多万头猪死亡，迄今为止仍呈地方流行 J。因此，建立快速、敏感、特异 的检测方法来鉴别这两种瘸原菌，对防制猪链球菌病具有重要作用。 在 16SrDNA与23SrDNA之间，有一段连接序列，称为16S-23SrDNA间隔区(16S一23SrDNAgeneintergeniespacerre— gion，ISR)，是非功能区，所处的选择压力很小，进化速度是16SrDNA的lO倍，Schlege等 报道了ISR分析是一个鉴定 链球菌属内的种(包括猪链球菌)的很有力的工具。因此，笔者就从 16S-23SrDNAISR的高进化率特征人手设计引物， 使用PCR方法区分导致猪源链球菌病的两种重要病原——猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。 随着当前生物信息学的快速发展，许多重要的人畜共患病病原的全基因组序列和 16SrDNA，16S-23SrDNAISR，23S rDNA序列都已公布，可以在美国国立生物技术信息中心(NCBI)和英国基因组研究中心(Sanger)免费下载。同时，还可 利用NCBI中Primer—BLAST功能，以GenBank中收录的大量核苷酸序列作为模板进行 “虚拟 PCR”，为设计正确的PCR 引物和检测引物的特异性提供了优越的平台。本实验就是先下载大量序列进行分析比对，分别在 16SrDNA末端和23S rDNA前端保守区设计了上下游引物，在Primer—BLAST中验证引物的特异性 ，然后再进行PCR的操作，确保实验的真实 可靠性。通过PER，发现实验中的21株猪链球菌均扩增出长度约为 1100bp的片段，8株马链球菌兽疫亚种均扩出约 1300bp的片段，其他属菌株和阴性对照无结果。这样，由PC