人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染.pdfVIP

山东医药 2011年第 5l卷第 26期 人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建 及 U937细胞系的转染 顾立学。罗俊生 ，王 瑞，冯 旭 。关 宁，霍晓川 (辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 121001) 摘要：目的 构建人胆固醇酯水解酶(hCEH)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP．N1．hCEH，并观察其转染单核 巨噬细胞株U937后，细胞中hCEH的表达情况。方法 以人肝细胞 L．02总RNA为模板，采用RT—PCR技术扩增 hCEH编码区序列 ，将扩增片段插入到pMD19．T载体中，回收、纯化 目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体 上，经双酶切、测序鉴定后，转染 U937，观察 U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT．PCR扩增hCEH基因的 编码区序列获得 1条约1．7kb的片段，与预期片段大小相符 ；以pEGFP．N1为载体，成功构建重组表达质粒pEGFP— N1-hCEH，该质粒可以在 U937中表达。结论 成功构建 pEGFP．N1．hCEH，用其转染 12937后，细胞中pEGFP—N1一 hCEH大量表达。 关键词：人胆固醇酯水解酶 ；真核表达载体；单核巨噬细胞；U937细胞 ；转染 中图分类号：R543．5 文献标志码 ：A 文章编号 ：1002-266X(2011)26-0014-03 ConstructionofeukaryoticvectorpEGFP—N1一hCEH andestablishmentofstable transfectantU937cellIine GULi-xu~，LUOJun—sheng，WANGRui，FENGXu，GUAN M ，HUOXiao—chuan (FirstAjfiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity，Jinzhou121001，P．R．China) Abstract：Objective Toconstructhumancholesterolesterhydmlase(hCEH)eukaryotieexpressionvectorpEGFP— N1一hCEH ，andobservetheirmonoeyte—maerophagecelllineU937expression．M ethods Humna livercelllinesL-02total RNA astemplate，amplifiedbyRT-PCR applicationshCEH codingsequence，theamplifiedfragmentswereinsertedinto pMD19-T vector，rceovery，purificationfragmentwassubclonde intopEGFP-N1eukaryotieexpressionvectorbyrestriction enzymedigestion，DNA sequencing，htetransfectedmonocyte-macrophagecelllineU937，andob~rve itsexpressionin U937ceils．Results RT—PCR amplificationofgenecdeingsequence hCEH obtaina1．7kbfragmentofthetreaty．inline witlItheexpectedfragmentsize．RceombinnatplasmidpEGFP-N1一hCEH wassuccessfullyconstructde wi山 pEGFP—N1a8 carrier．Genetransfcetionexperimentsshowde htattherecombinnatexpressinU937cells．Condusions Theeukaryotic expressionvcetorpEGFP—N1一hCEH issuccessfullyconstructed，na dexpressinU937cellsaftertransfeetion． Keywords：cholesterolesterhydmlase：eukaryotieexpressionvcetor；monocyte-macmphagec