重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察.pdfVIP

主垦 理生理 蠢 eseJournalofPathophysiology 2008，24(6)：1155—1160 · l155 · [文章编号】 1000—4718(2008)06—1155—06 重组人 CRP的表达纯化及 其内化进入 HeLa细胞的观察 陈腾祥， 李红梅， 胡水旺， 赵明哲， 刘亚伟， 刘靖华， 姜 勇 (南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室，广东 广州510515) [摘 要】 目的：构建人 C一反应蛋白(CRP)原核表达载体 ，表达纯化his—EGFP—CRP蛋白，观察其能否内 化进入HeLa肿瘤细胞。方法：利用特异性引物 ，从p91023／CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表 达载体pETI4b／MCS—EGFP一(N)上；对 阳性克隆进行 PCR、酶切和测序鉴定，并将其转化到大肠杆菌 BI21 (DF3)中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化，梯度透析复性，并与HeLa细胞孵育，利用荧光显微镜观察 其内化入胞。结果：PCR、双酶切和测序鉴定表明，pETI4b／EGFP—hCRP原核表达质粒构建正确；转化实验发现 ， 该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达；蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明，复性后的表达产物可结合于 HeLa细胞膜 ，孵育一定时间后，可定位于胞质及胞核。结论：成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的 人CRP原核表达载体，该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his—EGFP—CRP，纯化复性后 的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合，并能内化入胞，移位入核。 [关键词】 C反应蛋白；载体构建；基因表达 ；蛋白质复性；HeLa细胞 [中图分类号】 R730．23；Q344+．13 [文献标识码】 A Expressionandpurification0fre—constructedhumanCRP andobserva． tionofitsinternalization intoHeLacells CHENTeng—xiang，LIHong—mei，HU Shui—wang，ZHAO Ming—zhe，UU Ya—wei， LIU Jing—hua．JIANGYong (KeyLaboratoryofFunctionalProteomicsofGuangdongProvince，DepartmentofPathophysoilogy，SouthernMedicalUniver- sity，Guangzhou510515，China．E—mail：yfiang@fiill,ltnu．corn) [ABSTRACT] AIM：ToconstructprokaryoticexpressionvectorforhumanC—reactiveprotein(CRP)，toacquire thefunctionalfusionproteinpurifiedfromBL21(DE3)transformedwithvectorpETI4b／EGFP—hCRP，andtoobservethe internalizationofhtefusionproteinhis—EGFP—CRP intotumorcelllineHeLa．M ETHODS：CRP genesequencewas amplifiedwiththevectorp91023／CRPastemplatebyPCR，nadwasinsertedintovectorpETI4h／MCS—EGFP一(N)36to constructprokaryoticexpressionvector．TheE colicellsBL21(DE3)trnasfomredwiht there ～constructde vector pETI4b／EGFP—hCRPwasinducedbyisopropyl—B—D—thiogalactopyrnaoside(IPTG)，nadtheexpressedproteinhis—