新型抗TfR四价scfv的构建与表达.pdfVIP

第四届垒国大学生刨新年会 Fon蚰0ct201 2011年10月 Stodents’Cmtivity The4thChicleUniv盯sity 速增殖细胞的跨膜糖蛋白．属于一种转运蛋白，以内吞形式舟导铁的吸收，与细胞增殖期所 需物质的转运有密切关系，具有促进肝癌细胞增殖，增加肿瘤血管生成，加速肿癌侵袭和转 移等教应。细胞膜TfR在正常组织器官中含量很少，在肿瘤细胞表面都高度表达，在肝脏肿 瘤细胞表面其表达尤其明显。因此。抗TfR抗体2被认为是目前用于肿瘤定位诊断可行度较高 的分子。在沈关心教授的指导下，我们制定了课题的研究方向“新型抗TfR四价scFv的构建 与表达”。本课题以免症学和分子生物学知识为基础，构建与表达抗TFR四价抗体．为进一步 探讨其介导受体交联的功能奠定基础， 2特色以及翻新之处 转铣蛋白受体(TfR)在正常组织器官中含量很少，但在肿瘤细胞表面其表达量明显高于 正常组织，将其作为肿瘤诊断、体内显像发治疗的靶点．是目前研究的热点。单链抗体(scFv) A B 魂“獬弋 圉1p53四聚功能域示意图’。 是利用基园工程技术对抗体进行改造以降低分子量而有利于放免显像．在此基础上发展的多 价微型抗体则可进一步提高抗体的亲和力。我们利用人p53四聚功能域3(p53TD如图1所示) 表达产物可自动装配成四聚体这一特点，设计构建抗TfRscFv／人p53四聚功能域融合基因， 并进行原核表达和活性测定。在scFv基因后连接一段能自我折叠形成多聚体的肽段序列HSA“， HSA的可折叠肚由23个氪基酸组成，柔性好，将其作为一个连接的媒介．在p53四价功能域 的基础上，构建新的多价功能域．该功能域表达后可以自动组装成四聚体。获得的四价抗 TfR—scFv可以特异性的结合TfR+细胞．具有较好的生物学活性，并且亲和活性明显高于scFv， 为该抗体进一步体内外作用机制以及抗瘤效应实验研究奠定了基础，并且为提高抗体亲和活 性，制备高亲和活性抗体提供了新思路。 3砑}宄内軎爱拄爿}黼 本研宄分为两个部分(技术路线如圈2)，第一部分主要是在抗TfR的单链抗体基础上设 计、构建四价基因工程抗体的表达载体：第二部分主要是表达、纯化四价抗体，以及研究其 与肿瘤细胞结合的特性。 第四届全国大学生创新年会 Forum 2011年lO月 The4thChinese Students’Creativity University 图2技术路线图 3．1四价抗体表达藏体的构建 制备四价抗体的方法有两种，一种是利用化学交联的方法制备二聚体，另一种则是用基 因工程的方法构建。我们采用基因工程的方法构建四价抗体，通过将人p53四聚化功能域克 隆至抗TfR-scFv的C端，并通过人血清白蛋白(HSA)的可折叠肽的连接，构建一种新的多 价功能域，通过酶切鉴定以及测序分析证明四价抗体表达载体构建成功。该功能域表达后可 以自动组装成四聚体，并且HSA的可折叠肽由23个氨基酸组成、柔性好，不但可以保证四价 功能域与基因工程抗体的空间构象互不影响，还可使基因工程抗体四聚体中的4个抗体同时 与距离较远的抗原结合，进一步增加四聚体抗体的功能性亲和力。有资料表明由P53四聚化 后的表达产物计算机软件分析结果为，融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体，并具有四 条长的、柔性好的多肽，可确保每个抗体空间构象的独立性。 3．2四价抗体的衰达、纯化与活性爿定 将构建成功的表达载体转染大肠杆菌BL21表达，采用SDS和Westernblot检测表 达情况和分子量，在分子量及功能正确的基础上，用培养上清检测表达后，采用镍柱进行亲 和层析纯化目的抗体，用SDS检测纯化后抗体，Westernblot进一步确定其分子量与理 论值吻合。流式细胞术检测其与CD71阳性细胞的结合活性。 4目前进展情况 进入课题研究至今，我们已经成功构建了四价抗TfR的单链抗体的表达载体，图4为菌 落pcr电泳结果，所构建的质粒也委托上海invitrogen公司测序正确。成功