Notch与TF-β信号通路串话在乙醛激活肝星状细胞中的作用.pdfVIP

厂 Notch与TGF—B信号通路串话在乙醛激活 肝星状细胞中的作用 摘 要 目的：肝星状细胞(HSC)激活增殖并转分化为成纤维母细胞是 导致肝纤维化的主要病理机制之一。多条细胞信号转导途径参与了 HSC的激活增殖与转分化过程的调控。乙醛是激活HSC并导致酒精 性肝纤维化发生的关键分子。本实验以大鼠肝星状细胞株(HsC．T6) 为研究对象，采用乙醛激活HSC．T6增殖并转分化，并分别使用特异 性阻断剂SB．43 用，。进而探讨两条信号通路之间的“串话’’及其对肝星状细胞活化的 调控，为阐明Notch信号通路在肝纤维化中的作用及其分子机制提供 实验依据。方法：@HSC的培养及处理：HSC分为对照组和乙醛刺 ． 激组，每组又随机分为4组。对照组包括空白组、TGF．13阻断组 (SB．431542 200nmol／L)和 10／睨mol／L)、Notch阻断组(DAPT 10／比mol／L+DAPT ’TGF+Notch阻断组(sB．431542200nmol／L)。实验组 包括单纯乙醛刺激组、TGF．B阻断+乙醛刺激组、Notch阻断+乙醛刺 激组和TGF阻断+Notch阻断+乙醛刺激组。各组细胞培养至融合度 70％．80％时，0．4％胎牛血清DMEM培养基同步化处理细胞12h 后，更换为完全培养基。对照组用对应的抑制剂处理培养，刺激组在 对应的抑制剂预处理1h后给予乙醛刺激(200／％mol／L)刺激，每12h 补加一次，刺激24h。24h后收集各组细胞、细胞培养基上清液 ’紫外分光光度法检测总RNA浓度及纯度，根据操作流程用M．MLV 逆转录试剂盒进行逆转录反应得到cDNA，琼脂糖凝胶电泳分离 One软件分析结果。③Westernblot：裂解细胞并 PCR产物，Quantity ●● X X 用lmin。暗室中将PVDF膜迅速封入保鲜膜中，Kodakfilm压 X．ray 片，放射自显影5min。X．ray One软件分析结果。④检测指标： 1．5min，清水冲洗晾干。Quantity 法检测TIMP Smad3的mRNA水平；Western ’ ● 染色发现乙醛刺激明显促进HSC贴壁及重叠、明显促进HSC增殖和 显著增加胶原纤维蛋白的表达oMTr检测结果发现乙醛刺激明显增 ● 协同作用也有效阻断乙醛刺激对HSC活性的上调(PO．05)。②TIMP I和 I和FN表达变化：ELISA结果表明乙醛刺激组较对照组TIMP 醛刺激对TIMPI和FN的上调作用(PO．05)，但是未发现两种阻断 剂存在协同作用。③RBP．JK、Hesl和Smad3表达及活性的变化： RT-PCR和Western 达无显著