甲状腺功能亢进对家兔眼轮匝肌影响.docxVIP

山西岳拜大学焉士掌位论文材料与方法１．材料：Ｉ．Ｉ实验动物和分组成年健康家兔ｌＯ只，体重２．５－－－－－０．４ｋｇ，雌雄不限。由山西医科大学实验动物中心提供。１０只家兔随机分为２组，每组５只，即Ａ组（单纯甲状腺功能亢进组）；Ｂ组（对照组）。１．２实验试剂及配制实验试剂３，５，３’．三碘甲状腺氨酸（Ｔ３）１００ｍｇＳＩＧＭＡ公司Ｔ６３９７：肌球蛋白重链单体．ｆ（ＭＨＣ．ｆ）抗体Ｏ．ＩｍｌＮＣＬ－ＭＨＣｆ．肌球蛋白重链单体．ｓ（ＭＨＣ．ｓ）抗体Ｏ．１ｍｌＮＣＬ－ＭＨＣｓ；肌球蛋白重链单体－ｎ（ＭＨＣ．ｎ）抗体Ｏ．１ｍｌ结合-2ＮＣＬ－ＭＨＣｎ；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ公司Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ公司Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ公司可与ＭＨＣ－Ⅱ型结合可与ＭＨＣ－Ｉ型结合可与ＭＨＣ?新生儿型免疫组化试剂盒（Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ－ＰｌｕｓＫｉｔ）ＬＨＫ６１１－０６０（抗小鼠）；６０片晶美生物工程有限公司分装牛血清白蛋白（ＢＳＡ）ｌｏｇ南京凯基生物ＫＧＹ００８－１０；阿利新蓝８ＧＸ（Ａｌｃｉａｎｂｌｕｅ，８ＧＸ）ｌｇＡＭＲＥＳＣＯ公司Ａ０２９８；ＦＴ３放射免疫分析药盒ＦＴ４放射免疫分析药盒ＴＳＨ放射免疫分析药盒ＴＲＡｂ放射免疫分析药盒生工生物工程（上海）有限公司分装北京北方生物技术研究所；北京北方生物技术研究所；北京北方生物技术研究所；协和医药科技有限公司；Ｍａｙｏｒ’苏木素１２Ｉｎｌ博士德生物工程有限公司分装ＳＩＧＭＡ公司ＡＲ０００５：吐温．２０（Ｔｗｅｅｎ－２０）ｌＬａｏｗｅｉ－ｗａｃａｙ公司Ｔ７３７４）防脱载玻片５０片博士德生物工程有限公司ＡＲｌ０６５：３％过氧化氢多聚甲醛５０９５００ｍｌ天津市化学试剂三厂；上海西巴斯生物技术开发有限公司分装Ｍｅｒｃｋ公司；氯化钠（ＮａＣＬ）氯化钾ⅨｃＬ）磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰ０４?１２Ｉ－１２０）磷酸二氢钾（ＫＨ２Ｐ０４?２Ｈ２０）枸椽酸三钠（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３０７＂２Ｈ２０）５００９分析纯５００９分析纯５００９分柝纯５００９分析纯５００９分析纯２天津市化学试剂三厂；天津市化学试剂三厂；天津市化学试剂三厂：天津市化学试剂三厂；天津市化学试剂三厂；山西医辩大学鼍士学位论文枸椽酸（Ｃ６Ｉ－１８０７＂Ｈ２０）等渗盐溶液（Ｒｉｎｇｅｒ液）冰乙酸５００９分析纯５００ｒＩｌｌ５００ｍ１分析纯天津市化学试剂三厂；浙江济民制药有限公司；中国中邦化工厂（上海）。缓冲液的配制磷酸盐缓冲液（ＰＢｓ）：磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰ０４?１２Ｈ２０）１．４４９，磷酸二氢钾（１矾Ｐ０４?２Ｈ２０）０．２４９，氯化钠（ＮａＣＬ）ｇｇ，氯化钾（ＫＣＬ）０．２９，加入去离子水８００ｍｌ中，调节ＰＨ７．２０．４，加至总量１０００ｍｌ；枸椽酸盐缓冲液（Ｃｉｔｒａｔｅ）：１０００ｍｌ蒸馏水中加枸椽酸三钠（Ｃ６ＨｓＮａ３０Ｔ＂２Ｈ２０）３９，枸椽酸（Ｃ６Ｈ８０７?Ｈ２０）０．４９，ＰＨ６．Ｏ；４％中性福尔马林液：多聚甲醛８９，加ＰＢＳ液５００ｍｌ加热（６０．８０＂１２），使多聚甲醛完全溶解呈清亮状，室温下冷却。１．３实验器材图像分析系统：ＭＩＡＳ．２０００图像分析系统四）ｒｌＪＪＩ大智胜软件股份有限公司；放射免疫分析系统：ＳＮ．６９５Ｂ型放射免疫ｙ计数测量系统上海核所日环光电仪器有限公司；离心机：恒温离心机德国ＨＥＲＭＬＥ公司造ＺＫ３６５；电子精密天平：ＢＳ．１２４８北京赛多利斯仪器系统有限公司；兔箱、局部灯、注射器５ｍｌ、试管、碘伏。２．实验方法２．１甲状腺功能亢进动物模型的建立使用ＩＭＮａＯＨｌｍｌ溶解１００ｍｇＴ３粉剂，Ｒｉｎｇｅｒ液稀释，并将液体ＰＨ值调到７．２—７．４，最终配制成浓度为０．１ｍｇ／ｍｌ的Ｂ稀释液。Ａ组（单纯甲状腺功能亢进组）：助手固定家兔，使其腹部朝上，头低腹高位。碘伏消毒注射部位，于家兔后腹部腹白线旁ｌｅｎａ进针，由实验动物产生临床甲亢的标准实验设计剂量Ｏ．２ｍｇ／ｋｇ．ｗｔ给予腹腔注射Ｔ３稀释液，隔日一次，共一月。家兔食量、水量不予以控制。每日观察各项甲亢指标：体重、食物摄入、水量摄入、腹泻及兴奋性。Ｂ组（对照组）：隔日腹腔注射２ｍｌ／ｋｇ．ｗｔ的Ｒｉｎｇｅｒ液，共１月。２．２甲亢动物模型评估：甲亢体征监测体重指标：于每早喂食、喂水前称量体重，记录。血清学指标分别于给药前、给药ｌ周、２周、４周及处死前于家兔耳缘静脉采血５ｍｌ，离心取上清液，测定血清ＦＴ３、ＦＴ４、ＴＳＨ、ＴＲＡｂ浓度。２．３病理学标本制作腹腔注射Ｔ３液１月，空气栓塞法处死动物，迅速取双眼上脸标本，置于４％中性福尔３山西医辩大学焉士掌位论史马林液中固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。４ｐｍ连续切片，切面为上睑横截面。ＨＥ染色将石蜡切片置于６０１２烤箱烤片ｌ小时，防止脱片。常规脱蜡至水，苏木素染液染色５ｍｉｎ，水洗；盐酸酒精分化２０ｓ，水洗；Ｏ．５％伊红复染２ｍｉｎ，常