雷公藤多甙对哮喘大鼠气道转化生长因子-β-%2c1-mRNA和Ⅲ型胶原表达影响.docxVIP

山西医科大学磺士学位论文材料和方法１．研究对象健康雄性ＷＬｓｔａｒ大鼠３０只，平均体重（１８０－Ｊ＝１０）ｇ。山西医科大学实验动物中心提供。２．主要试剂及药品卵白蛋ｌ刍（ＯＶＡ）灭活百日咳杆菌菌苗雷公藤多甙精制纯原料（纯度达９９％以上）一抗ⅡＩ型胶原兔抗鼠多克隆抗体（工作浓度ｌ：１５０）二抗生物素标记的山羊抗兔ＩｇＧ抗体三抗过氧化物酶标记的链霉亲和素二氨基联苯胺（ＤＡＢ）试剂盒美国Ｓｉｇｍａ公司产品北京生物研究所江苏美通药业集团公司武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物工程公司武汉博士德生物工程公司Ｔｒｉｚｏｌ，反转录酶ＴａＫａＲａ生物工程（大连）有限公司ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ上海杰美基因医药科技有限公司引物合成氯仿、异丙醇、乙醇、氢氧化铝干粉３．主要仪器设备：光学显微镜电热恒温水浴锅微量加样器自动双重纯水蒸馏器ＪＡ２００３电子天平切片机ＭＩＡＳ一２０００医学图像分析系统电泳仪ＰＣＲ自动扩增仪（ＰＴＣ．１００）紫外凝胶图像分析系统（ＧＩＳ．２０２１）北京奥科生物技术有限责公司北京北化精细化学品有限公司日本Ｏｌｙｍｐｕｓ－－ＣＸ２１北京市长风仪器仪表公司芬兰ＴｈｅｉｍｏＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ公司上海亚荣生化仪器厂上海第二天平仪器厂德国ＤＥＬＩＣＡ公司四川川大智胜软件股份有限公司北京六一仪器厂美国ＭＪ公司天能科技（上海）有限公司４．实验方法：４．１大鼠哮喘模型的建立：实验大鼠随机分成对照组、哮喘组和雷公藤多甙组，每组１０只。参照文献制备，以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功【１７】“８ｌ。具体方法：哮喘组：分别于第ｌ天和第８天以１０％ＯＶＡｌｍｌ、氢氧化铝ｌＯＯｍｇ、灭活百山西医科大学硪士学位论文日咳杆菌疫苗（５ｘ１０９，个，２ｍ１）腹腔注射致敏：第１４天后将大鼠置于透明密闭容器中给予Ｉ％ＯＶＡ溶液６０ｍｌ雾化吸入激发，中等雾量，每日１次，每次４０ｍｉｎ左右。雾化吸入Ｉ％ＯＶＡ激发２周后，于雾化激发前３０ｍｉｎ给生理盐水ｌｍｌ灌胃。雷公藤多甙组：前期制备同哮喘组，雾化吸入Ｉ％ＯＶＡ激发２周后，于雾化激发前３０ｍｉｎ给雷公藤多甙精制纯原料８ｍｇ／ｋｇ（１ｒｎｌ）灌‘１９】，其余条件同哮喘组。对照组：以生理盐水代替ＯＶＡ于第１天和第８天腹腔注射（２ｍ１），１４天后给予生理盐水超声雾化吸入（６０ｒａｌ）。雾化吸入２周后，于雾化前３０ｒａｉｎ给生理盐水ｌｍｌ灌胃。４．２标本的制备：雾化激发ｌＯ周后，２０％乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉放血致死大鼠，无菌条件下取右肺组织，迅速液氮冷冻，．８０＂Ｃ冰箱保存备用；左肺注入４％多聚甲醛３ｒｎｌ内固定ｌＯ分钟，纵向分为两块，用４％多聚甲醛固定２４ｈ用于免疫组化、ＨＥ染色，经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。选择不同蜡块切片，厚度为４１ｍａ，６０℃烤片４小时固定。４．３肺组织Ｉ－ＩＥ染色：＋（１）石蜡切片常规脱蜡至水。（２）将切片浸入苏木素染液染色５分，自来水冲洗。（３）ｌ％盐酸（７０％酒精配制）溶液分色１５秒，自来水冲洗。“）ｌ％氨水蓝化１５秒，自来水冲洗。（５）ｌ％伊红浸染５分，自来水冲洗。（６）７５％、８５％、９５％、１００％酒精逐级脱水。（７）二甲苯透明２分）（２次。（８）树胶封片。（９）显微镜下观察。４．４支气管上皮细胞ＩＩＩ型胶原免疫组织化学染色：石蜡切片厚４Ｗａ，脱蜡至水，采用链霉亲和素一过氧化酶免疫组化试剂盒（ＳＡＢＣ法）进行免疫组织化学染色，一抗工作浓度为１：１５０，阴性对照为磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）代替一抗。操作步骤按免疫组织化学检测试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：（１）二甲苯２０分钟×３次，常规脱蜡。（２）１００％，９０％，８０％，７０％梯度酒精各ｌＯ分钟水化。（３）３％Ｈ２０２（３０％Ｈ２０２１份＋蒸馏水１０份）室温处理１０分钟以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤３次。（４）复合消化液修复抗原，３７℃消化１０分钟，蒸馏水洗涤５分钟×３次。（５）冷却至室温后ＰＢＳ洗涤，５分钟）（２次。（６）滴加５％ＢＳＡ封闭液，室温２０分钟，以减少非特异性结合。不洗，甩去多余液体。（７）滴加适当稀释的一抗，阴性对照以ＰＢＳ代替一抗，放入湿盒４＂Ｃ冰箱过夜。（８）次日由冰箱中取出湿盒，ＰＢＳ洗涤５分钟×３次。滴加二抗（生物素化羊抗兔ＩｇＧ），山西医科大学磺士学位论文３７℃温育２０分钟，ＰＢＳ洗涤５分钟×３次。（９）滴加ｓＡＢｃ（链霉亲和素一过氧化物酶复合物），３７＂Ｃ温育２０分钟，ＰＢＳ洗涤５分钟×３次。Ｏｏ）３，３－二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色（ＤＡＢ现配，ｌｍｌ蒸馏水中加入ＤＡＢ显色液Ａ、Ｂ、Ｃ各一滴，混匀，滴加于玻片上）。（１１）于显微镜下观察，适时终止反应（置于蒸馏水中）。（１２）苏木素复染数秒，ｌ％盐酸酒精液数秒使细胞核去分化，ｌ％氨