兔骨髓间充质干细胞自体移植修复关节软骨缺损的初步研讨.pdfVIP

兔骨髓间充质干细胞自体移植修复关节软骨缺损的初步研究 杨劲松，杨渊z (1．广西南宁市第一人民医院；2．广西ON骨伤科研究所) 关节软骨由于自身结构缺乏血运的特点以及关节面处在一个经常受力，反复摩擦， 相互挤压的状态，关节软骨极易受损。局限于软骨内的损伤几乎无修复反应，久之易导 致骨关节退行性变。全层损伤后骨髓参与修复，形成的新生组织多为纤维组织与纤维软 骨，力学性能差，不能满足关节功能需要。以干细胞工程为代表的现代组织工程学是近 年来迅速发展起来的一个新领域。骨髓间充质干细胞的可获得性、可扩增性及可多向分 化性为我们展示了良好的研究与应用前景，在软骨缺损修复中有重要的临床应用价值。 本实验旨在探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)自体移植修复全层软骨缺损的实验效果， 以及纤维蛋白封闭剂(FibrinSealant，FS)作为载体的可行性。 1材料与方法 1．1兔MSCs的提取、分离、培养、传代扩增 取新西兰大白兔12只，4个月龄，体重2．5～3．0kg。0．25％戊巴比妥钠(0．2ml ／kg)静脉注射麻醉，同时用0．75％利多卡于手术部位施以局部麻醉，在无菌操作下切 开胫前外侧皮肤，暴露出胫骨，钻出直径5mm通髓腔的小孔，插入9号留置针进髓腔， U／ml肝素的DMEM培养液10ml，反复2～3次冲出 外接10ml注射器，内含3000 骨髓，经自制的引流器收集到烧杯中，用100目的筛网过滤后移至50ml无菌离心管，1200 取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞，移至另一无菌试管，以DMEM洗涤2次，悬浮。 X 将上述分离所得骨髓中单核细胞按1．0 u (同时加有青霉素100 壁细胞，同时更换新鲜的培养液，以后每隔2～3天更换一次培养液，用倒置相差显微 IX50)观察细胞形态及其生长变化并摄像。约12～15天，细胞生长铺满 镜(Olympus 传代4次，MSCs铺满8个100ml培养瓶瓶底。 1．2电镜观察MSOs 收集MSCs原代和诱导14天的骨髓间充质干细胞，常规超薄切片，扫描、透视电 镜观察细胞外的基质形成情况及细胞超微结构的变化。 1．3膝关节软骨缺损修复 实验分组：12只实验兔的双侧膝关节内外髁共48个髁，其中随机选16个髁植入自 髁为空白对照组。仰卧位固定兔作两侧膝内侧切口，膑骨外侧脱位，显露股骨滑车关节 面，用手摇钻造成一直径4mm的关节软骨缺损，深达软骨下骨。MSCs组关节软骨缺损 滴注0．05mlDMEM(内含MSCs 白对照组未作任何处理。12只实验兔按分组进行处理，术后不固定膝关节，笼内饲养， 自由活动。肌注青霉素80万U，每天2次，连续3天。 1．4组织学观察 术后观察膝关节活动度。在术后14周切取缺损处软骨组织块，中性福尔马林液固定 48小时，脱钙2天，石蜡包埋，切片，行HE和Masson’s三色染色。 1．5诱导MSCs向成骨细胞分化 在培养第2代细胞的培养体系中，加入地塞米松2u 司)，骨形成蛋白一225“l(BMP一2终浓度为62．5ug／m1，Sigma公司)，D一磷酸甘油 14天和28天进行碱性磷酸酶和钙结节染色。 1．6关节软骨组织学产定量计分(改良自Pineda方法[11) 对股骨内侧髁缺损区的组织从5个方面进行评分：①细胞形态：透明软骨细胞0；透 明软骨细胞为主1；纤维软骨细胞为主2；非软骨为主3，全部非软骨4。②基质染色：正染 色0；轻度减弱ll明显减弱2{未着色3。③表面平整：平3／40；中1／2—3／4ll 不平1／4—1／2 1／3—2／3 2 2l严重不平1／43。④软骨厚度：2／30I l，1／3 ⑤与宿主结合：两边结合0；一边结合l；不结合2。 1．7疗效评定121 对股骨内侧髁缺损修复区各组14周时的疗效按下列标准进行评定。完全愈合：缺损 区内分化正常罗骨细胞被基质包绕，分层排列，产生组织表面平滑，与周围组织紧密相 连，不完全愈合：修复组织软骨细胞分化较差，或含幼稚软骨细胞，细胞排列不规则，新 生组织表面平滑或粗糙，与周围组织完全或部分连接，未愈合：缺损区内含极少量软骨 组织，由纤维肉