EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征方法建立和应用.docVIP

EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征方法建立和应用 　　摘要：目前，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）已成为全球范围内影响较广的猪类重要疾病之一，因此建立快速、有效的猪繁殖?c呼吸综合征病毒（PRRSV）检测技术成为预防和控制PRRS传播的关键。在序列分析的基础上，设计特异性引物，建立基于熔解曲线分析的EvaGreen实时荧光定量PCR检测PRRSV方法。该方法能够特异性扩增PRRSV，并用经熔解曲线分析产生特异性的熔解峰，而非靶标病毒未产生非特异性扩增；PRRSV的检测灵敏度可达 50 copies/μL；批内、批间重复试验中变异系数均在2%以内；对118份临床样品进行检测，阳性率为31.4%，与普通PCR检测结果相符率为100%。结果表明，建立的EvaGreen实时荧光定量PCR检测PRRSV方法具有较高的特异性、灵敏度和良好的重复性，可用于临床PRRSV感染的早期诊断及分子流行病学调查。 　　关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）；EvaGreen实时荧光定量PCR；熔解曲线分析；检测 　　中图分类号： S855.3文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）09-0123-04 　　猪繁殖与呼吸综合征病毒别称蓝耳病病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，简称PRRSV），属动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是一种单股正链RNA病毒，全基因组序列约为15 kb，含9个开放阅读框（ORF），其中ORF1a、ORF1b占整个病毒基因组的80%，ORF1a编码的非结构蛋白Nsp-2蛋白在病毒复制和致病过程中发挥重要作用，ORF2a、ORF2b、ORFs3～7各自编码病毒结构蛋白GP2、E、GP3、 GP4、 GP5、M、N[1-3]。PRRSV基因组毒株间具有较大的遗传变异性，根据PRRSV基因型差异，将PRRSV分为美洲型、欧洲型，两者序列同源性约为63%[4-5]。 　　由PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）是以仔猪呼吸衰竭和孕猪流产、胎儿畸变、早产、死产及木乃伊胎等繁殖障碍为主要症状的传染病[6]，以高致病率、高死亡率为主要特征，该病于1987年在美国首次被发现，目前遍布世界各个养猪国家[7-8]。1992年世界动物卫生组织（Office International Desepizooties，简称OIE）将猪繁殖与呼吸综合征列为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病[9]。我国于1996年首次报道该病，主要为美洲型。2006年，PRRSV的高致病性NA型病毒株（HP-PRRSV）在我国各地养猪业中引起大规模疾病暴发，给我国猪群养殖业带来了沉重的经济损失[10-11]。因此，建立及时快速的PRRSV检测方法，对预防和控制该疫情有重要的作用。 　　目前用于诊断PRRSV的方法有病毒分离培养、间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，这些检测手段存在耗时长、灵敏度低、对感染早期无法确诊等缺点。实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，简称real-time PCR）是一种自动化程度高、特异性强、灵敏度好、可以实时监测整个PCR进程的核酸检测技术，包括荧光杂交探针、荧光染料2类[12]。染料法实时定量PCR省去了设计、标记荧光探针等流程，检测费用较探针法相对降低，同时适用于各种PCR扩增体系[13-14]。新型饱和染料EvaGreen 具有很强的荧光信号和稳定性，解决了SYBR Green染料重分布等缺点，是一种适用于实时荧光定量PCR的DNA结合荧光染料[15]。本研究拟建立1种基于EvaGreen的PRRSV实时荧光定量PCR检测方法，应用于猪繁殖与呼吸综合征的早期诊断，同时也可为猪繁殖与呼吸综合征的诊断、试剂研发、流行病学研究等奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1病毒和临床样品PRRSV、猪瘟病毒（classical swine fever virus，简称CSFV）及猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，简称PCV2）疫苗株由笔者所在实验室保存；猪细小病毒（porcine parvovirus，简称PPV）疫苗干粉，购自北京中海保健科技有限公司；伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，简称PRV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，简称JEV）疫苗干粉，购自武汉科前动物生物制品有限公司。收集来自湖北省、福建省、安徽省、广东省、河南省、浙江省及天津等地猪场的共58份血清样品和在杭州市内不同猪肉市场收集的共60份包