ELISA中的试剂－免疫吸附剂.doc

PAGE PAGE 1 ELISA中的试剂－免疫吸附剂 在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定,ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物,完整的试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中）参考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液 3.1　免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月有些不完整的试盒仅供应包被用抗原或抗体检测人员需自行包被以下简述固相载体和包被过程 3.1.1　固相载体 固相载体在测定过程中作为吸附剂和容器不参与化学反应可作中载体的材料很多最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性加之它的价格低廉所以被普遍采用聚苯乙烯为塑料可制成各种形式 载体的形状主要有三种：微量滴定板小珠和小试管以微量滴定板最为常用专用于EILSA的产品称为板国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式为便于作少量标本的检测有制成8联孔条或12联孔条的放入座架后大小与标准板相同板的特点是可以同时进行大量标本的检测并可在特制的比色计上迅速读出结果现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的检测包括加样洗涤保温比色等步骤对操作的标准化极为有利聚苯乙烯经射线照射后其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多但用于间接法测抗体时空白值较大 良好的板应该是吸附性能好空白值低孔底透明度高各板之间同一板各孔之间同一板各孔之间性能相近聚苯乙烯板由于原料的不同和制作工艺的差别各种产品的质量差异很大因此每一批号的板在使用前须事先检查其性能常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被板各孔洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体保温后洗涤加底物显色终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度控制反应条件使各孔读数在吸光度0.8左右计算全部读数的平均值所有单个读数与全部读数的均数之差应小于10% 与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯作为固相载体聚氯乙烯的特点为质软板薄可剪割价廉但光洁度不如聚苯乙烯板孔底亦不如聚苯乙烯平整聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高但空白值也略高 为比较不同固相在某一测定中的优劣可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本将它们进行一系列稀释后在不同的固相载体上按预定的操作步骤进行测定然后比较结果在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大这种载体就是这一测定项目的最合适的固相载体 在中用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠表面经磨砂处理后吸附面积大大增加板孔的吸附面积约为200mm2小珠均为1000mm2将近板孔的5倍吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加再者球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态因此珠式的反应往往更为灵敏小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底使用特殊的洗涤器使小珠在洗涤过程中滚动淋洗其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好但由于磨砂工艺的难度较大小珠的均一性较差 小试管作为固相载体也有较大的吸附表面而且标本的反应量也相应增加板式及珠式的标本量一般为100-200ul而小试管可根据需要加大反应体积标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高小试管还可以当作比色杯最后直接放入分光光度计中比色 也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为固相载体的其优点是表面积极大反应在悬液中进行其速率与液相反应近似以含铁的磁性微粒作为固相载体反应后用磁铁的吸引进行分离洗涤方便试剂盒一般均配以特殊仪器 3.1.2　包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)换言之包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于这种物理吸附是非特异性的受蛋白质的分子量等电点浓度等的影响载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团故更易吸附到固相载体表面IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力其联结多发生在Fc段上抗体结合点暴露于外因此抗体的包被一般均采用直接吸附法蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露在这种情况下直接包被效果不佳可以采用间接的捕获包被法即先将针对该抗原的特异抗体作预包被其后通过抗原抗体反应使抗原固相化此间接结合在固相上的抗原远离载体表面其抗原决定簇也得以充分暴露间接包被的抗原经固相抗体的亲和层