医学生物化学基础及技术 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质实验.docVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质实验 一、目的要求 1.学习电泳原理和技术。 2.学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N，N-methylene-bisacylamide，简称Bis）在加速剂N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED）和催化剂过硫酸铵[ammonium persulfate（NH4）2S2O8，简称AP）或核黄素（ribofavin即vitamin B2，C17H20O6N4）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶 (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10～6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度（T）的选择与被分离物质分子量密切相关。 表1 分子量范围与凝胶浓度的关系 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳（如图1）和板状电泳（如图2），两者电泳原理完全相同。 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面） 样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 1.样品槽模板 2.长玻璃板 　　1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 (1)样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性； (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HCI解离出的氯根（CI-）尾随离子（trailing ion）或慢离子： 甘氨酸根mclαclmpαpmGαG（Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根） 有效迁移率=mα（m为迁移率，α为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； (c)电位梯度的不连续性； (2)分子筛效应 (3)电荷效应 图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带 C显示蛋白质样品分离成数个区带。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 三、试剂与器材 试剂：10%SDS、凝胶贮液（30%ACr-0.8%Bis）、分离胶缓冲液（3.0mol/L pH8.9Tris-HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.7Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、10%TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、1%琼脂糖溶液、0.05%考马斯亮兰R250、7%醋酸 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床 四、操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。 2.配胶 表2 SDS-不连续体系凝胶的制备 3.制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1ml注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（约3～4 mm），用于隔绝空气，使胶面平整。约30～60min凝胶完全聚合，则可看到水