【培训课件-临床基因组学】_临床基因组学-Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学.pptVIP

早期的Sanger 测序法 在4 组相互独立的测序反应体系中，分别加入4 种不同的ddNTP，其余成分（待测单链DNA 模板、DNA 聚合酶，引物和dNTP）相同。调整每个测序反应中dNTP 与ddNTP 的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA 每个可能掺入的位置都可能发生终止。 具体操作 如在第一个反应体系中加入ddATP，则ddATP 会随机地代替dATP 参加反应，从而在第一个反应体系中产生以A 结尾的不同长度的核苷酸链。同理其余三个反应体系分别产生了以T、G、C 结尾的不同长度的片段。 通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 和放射自显影检测可读取模板DNA 链互补的序列。 升级版Sanger 测序法 1. 使用荧光标记代替同位素标记，避开了放射性同位素对人体的辐射损伤（荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测）； 2. 使用毛细管电泳代替变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离时间缩短约25倍； 3. 使用DNA测序仪分析系统识别不同颜色的荧光，通过软件分析，自动读出待测DNA的核苷酸序列。 在早期Sanger 测序法的基础上发展起来 升级版Sanger 测序法 测序反应体系组分 A、C、T、G四种碱基各标一种颜色的发光基团 升级版Sanger 测序法 大名鼎鼎 ABI公司 BigDye ?Terminator Cycle Sequencing Kit + 3500系列/3730系列基因分析仪 将聚合酶，dNTP和ddNTP按合适比例预先混合 升级版Sanger 测序法 BigDye Terminators 四色荧光分别标记的发挥链终止剂作用的四种ddNTPs A、C、T、G四种碱基各标一种颜色的发光基团 反应混合物中含有不同荧光标记的ddNTP 与4 种dNTP。由于每种ddNTP 带有各自特定的荧光颜色，可以按照四种不同荧光来分别识别A/T/G/C，从而可以实现了一个反应管完成反应和1 个泳道同时判读4 种碱基。 升级版Sanger 测序法 步骤 √ × EGFR基因外显子18-21突变检测 背景 EGFR基因由28个外显子组成 EGFR基因突变主要集中在胞内段编码结构域(外显子18-21) 易瑞沙和特罗凯作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），是目前批准用于非小细胞肺癌靶向治疗的主要药物。 在东亚国家，约35%的NSCLC患者携带EGFR基因突变。EGFR基因突变与吉非替尼（易瑞沙?）和埃罗替尼（特罗凯?）的治疗有效率密切相关。 背景 EGFR基因外显子18-21突变检测 EGFR基因外显子18-21突变检测 具体操作 1.DNA模板的制备 样本类型：肿瘤部位新鲜冷冻材料；活检组织或手术样本的石蜡组织或石蜡组织切片 DNA提取 HE片 显微镜下病理学评估 确定肿瘤细胞 石蜡包埋组织 需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量，因为EGFR基因突变发生于肿瘤细胞中，正常细胞不含突变，要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 EGFR基因外显子18-21突变检测 具体操作 1.DNA模板的制备 EGFR基因外显子18-21片段扩增引物设计、合成 美国国家生物技术信息中心 (National Center For Biotechnology Information, NCBI) / 不完整的基因组区域 转录产物序列 真正翻译成蛋白的序列 EGFR基因外显子18-21突变检测 EGFR基因外显子18-21片段扩增引物设计、合成 具体操作 1.DNA模板的制备 正向引物序列 反向引物序列 外显子18序列 EGFR基因外显子18-21突变检测 具体操作 1.DNA模板的制备 EGFR基因外显子18-21片段扩增 EGFR基因外显子18-21突变检测 具体操作 1.DNA模板的制备 PCR产物纯化 PCR反应结束后体系组成 需要除去 去除残留的dNTPs： 以保持dNTP/ddNTPs的最佳比例 去除残留的引物： 保证引物特异性，避免多重测序 去除盐成分： 避免抑制测序酶活性 去除非特异PCR产物： 避免扩增出同源性区域 EGFR基因外显子18-21突变检测 具体操作 1.DNA模板的制备 PCR产物纯化 ExoSAP-IT酶是由两种水解酶组成的复合酶： 外切酶 Exonuclease I 虾碱性磷酸酶Shrimp