园林植物组织培养 (4).pdf

三、核酸体外扩增技术（PCR ） 1989 Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 PCR爆炸年 1993 Mullis荣获诺贝尔化学奖 1985在Cetus公 司发明了PCR 美国 Yellowstone 公园热泉 嗜热水生细菌 Thermus aq uaticus （一）PCR反应的原理 1. 全称 聚合酶链式反应 ，polymerase chain reaction 2. 原理  高温变性  低温退火  适温延伸  如此反复进行，每一次循环所产生DNA均能成为下一次循环的模 n 板，使两条引物间DNA特异区拷贝数扩增1倍，PCR产物以2 指数 形式迅速扩增 • 高温变性 ： 95℃下加热1min，将待扩增的靶DNA双链变性为两条单 链DNA模板 • 低温退火 ：37～55℃下，两条人工设计合成的寡核苷酸引物与互补的 单链DNA模板退火结合约1 min，形成部分双链 • 适温延伸 ：72℃左右保温1～2 min，以引物3’ 端为合成起点，以 dNTPs为原料，沿模板5’→3’ 方向延伸，合成新的DNA互补链 polymerase chain reaction （PCR ） Denaturing, double strands DNA become to be single strand. Annealing, part of primers combined with single strand DNA in specifically complemental locus. elongation, target gene as a template, a new complemented strand was synthesized. The number of target gene was double after every PCR cycle. 30 9 2 （1.07×10 ) of target gene copies can be obtained after 30 cycles of PCR （二）PCR反应体系的组分及其作用  PCR反应缓冲液 ：含50 mmol/L KCl ，10 ～50 mmol/L Tris·HCl ， 100 µg/L 明胶或BSA。提供适宜反应环境  Mg2+ ：浓度为1.5 ～2.0 mmol/L ，影响反应的特异性和扩增片段 的产率，过量非特异性扩增增加  模板DNA ：基因组DNA、质粒DNA、cDNA或RNA等；用量为 ng ～µg级；应溶于10 mmol/L TE缓冲液中（pH8.0)  dNTPs ：DNA合成的原料，浓度为20 ～200µmol/L ，4种dNTP必 须以等量浓度配制  引物（primer ）：与模板DNA区段两端序列互补的人工合成的 寡核苷酸段片段，引发DNA合成；长度10 ～30bp ，浓度0.1 ～0.5 µmol/L ，偏高会引起错配和非特异产物扩增  DNA聚合酶：催化DNA合成，TaqDNA聚合酶最适温度72℃ （三）PCR类型 1. 简并PCR  一般PCR引物:根据给定核苷酸序列设计的两条特异引物  简并PCR: 引物是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并 性的引物，由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库 Trp Asp Thr Ala G