凝胶层析法课件.pptVIP

为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下 降。整个洗脱过程中始终 保持一定的操作压 ，并不超限是很 必要的。流速不宜过快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变， 以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。 在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸 附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及 蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐 溶液进行洗脱。 离子浓度至少 0.02mol/L 方可获得较好的结果，因为凝胶含 有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用 盐等介质应比较容易除去才好，通常， 氨水、醋酸、甲酸铵 等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用 水和有机溶剂（如水 - 甲醇，水 - 丙酮等）的混合物进行洗脱。 洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图 显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。可见 较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄 而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀 释较轻。 流速对洗脱曲线的影响 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说， 细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分 离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低， 多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度 的 Sephadex G-25 柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。 一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白 质与盐类，称作 类分离 或 组分离 。另一类则是要将分 子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清 球蛋白与白蛋白，这叫做 分级分离 。后者对实验条件 和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类 为例，分别加以讨论 。 ? 将分子量极为悬殊的两类物质分开， 如蛋 白质与盐类，称作 类分离或组分离 。 将分子量相差不大的大分子物质加以分离 ， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做 分级 分离 。 ? 66 1 ．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子 组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离 分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量 大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。 也就是说大分子的分配系数 Kd= 0 ，小分子的 Kd ＝ 1 。这样能取得最好的分离效果 。 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白 质的分子量都大于 5000D ，而无机盐的分子量一般在 几十到几百之间。所以常选用 Sephadex G-25 凝胶 作为分离固定相，因为它的分离范围是 1000 ～ 5000D 。 被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两 侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其 Kd 值的差可达最大值 1 。对于分子量小于 5000D 的肽 类进行脱盐操作则常选用 Sephadex G-15 凝胶。 1 ．类分离 （ 1 ）使大分子的分配系数 K d =0 ； （ 2 ）小分子的 K d =1 。 选用 Sephadex G-25 凝胶，分离范围 1 000 。 000 ～ 5 69 2 ．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选 择凝胶型号时必须使各种物质的 Kd 值尽可能相差大 一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在 凝胶分离范围的一侧，也就是 Kd 不要都接近于 0 或 1 ， 而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的 两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有 3 个组分 的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入 ， 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的 3 倍， 并 小于排阻限的 1 ／ 3 。 因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝 胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分 分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子 组分分开。如用 Sephadex G-200 分离血清蛋白质的 效果要比 Sephadex G-150 为好。但也有人选用 G-150 ， 那是因为 G-200 强度太低不便操作的缘故（见下图）。 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图 2 ．分级分离 （ 1 ）使各种物质的 K d 值尽可能相差大。 （ 2 ）不使分子量分布在凝胶分离范围的 一侧。 （ 3 ） 分子量大于渗入限的 3 倍，并小于排 阻限的 1/3 。 如用 Sephadex G-200 分离血清蛋白质 的 效果要比 Sepha