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ox1对蛋白在体外培养的作用研究 摘要：目的：探讨Otx1(orthodenticle homeobox 1)蛋白在调节电压门控性钾通道中的作用，并分析其对体DNA，应用全细胞膜片钳记录N2a细胞中K+依赖的外向电流；通过电生理技术，分析Otx1对K+电流激活、失活和失活后恢复时间等参数的影响；通过细胞转染Otx1突变体，研究其对细胞增殖的影响。结果：过表达Otx1可增强电压依赖性外向K+电流，降低半失活电位，并延迟外向电流失活后恢复；星形胶质细胞瘤相关的Otx1突变体K321T和表达Kv4.2α也导致外向K+电流增强，并抑制N2a细胞的增殖。结论：Otx1可在体外培养的小鼠神经细胞中诱导电压依赖性K+电流，而K+电流可能参与细胞的增殖过程。 同源框转录因子参与大脑皮质的神经发育Otx1敲除小鼠表现出皮质神经元数量减少和大脑发育不全，皮质变薄本研究利用小鼠神经母细胞瘤N2a细胞作为神经细胞的体外模型，采用全细胞膜片钳记录分析Otx1对K材料和方法1 细胞与主要试剂N2a细胞购于上海细胞资源中心。DMEM培养液、胎牛血清、0.25%trypsin-EDTA和HBSS(HanksBalanced Salt Solution）购自Gibco。青、链霉素和4-氨基吡啶（4-aminopyridine,4-AP）购自Sigma;OptiMEM和Lipofectamine 3000购自Invitrogen；点突变试剂盒购自天根生化科技有限公司；Cell-Light2 实验仪器二氧化碳细胞培养箱和Countess3 主要方法3.1 细胞培养和质粒转染N2a细胞培养在含有10%胎牛血清和1%-青链霉素的DMEM中。细胞置于5%CO3.2 Ed U染色采用Cell-Light3.3 电生理学记录为了研究Otx1对钾电流的调节作用，参照《Bioelectromagnetism》中关于Active Behavior of the Cell Membrane的方法进行电生理学实验，记录分别转染Otx1-m Cherry和对照m Cherry、Otx1突变体K321T或Y320C和对照m Cherry的N2a细胞的电生理参数。所有实验均在室温[（22±1）℃]下进行。利用微电极拉制仪P-97拉制记录所需的玻璃微电极。在记录电极内加入电极内液，电极内液成分（mmol/L):KCl 150,Mg Cl为了构建动作电位的稳态激活和失活曲线，按照结果部分中描述的步骤给予相应电压刺激后记录电流。标准化各电流幅值（I/I4 统计学处理所有实验至少重复3次以上。所有数据均以均数±标准误（Mean±SEM）表示。使用Students t检验或单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验，分析组间差异。以P0.05差异有统计学意义。结果1 Otx1促进外向K为了探索Otx1对神经细胞电生理特性的调节作用，我们首先克隆了过表达Otx1的Otx1-m Cherry。我们将对照载体和Otx1-m Cherry分别转染至N2a细胞中，24 h后用全细胞膜片钳记录去极化激活的外向电流。为了阻断电压门控的Na2 Otx1对K为了研究Otx1对KK3 Otx1引起外向电流失活后的恢复时间延长失活后，Kv逐渐恢复并为下一次激活做好准备。为了研究Kv的重新激活，保持电位在-90 m V，给予3 s、+40 m V的预脉冲后，将N2a细胞的膜电位钳回到-80 m V，维持10 ms～4 s的不等时间。最后在测试脉冲+40 m V下测量电流，以评估外向电流随着复极化时间的恢复程度（图4A）。每个测试脉冲下的电流峰值归一化后，针对复极化的时间做图（图4B）。按单项指数式求出恢复时间常数τ。对照组τ=（143.61±13.90) ms,Otx1过表达组τ=（293.33±25.70)ms(P0.01），见图4C。这表明Otx1延缓了Kv电流的恢复。4 OTX1诱导的外向K为了探讨N2a细胞中的K讨论Otx1突变小鼠表现出自发性癫痫发作K人类OTX1基因位于2号染色体p15-16.1。染色体2p15-16.1的微删除引起智力发育障碍、自闭症、癫痫和小头畸形