抗黏液蛋白1单抗偶联吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对胰腺癌模型动物抑瘤作用的实验研究.docx

抗黏液蛋白1单抗偶联吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对胰腺癌模型动物抑瘤作用的实验研究 胰腺癌是严重威胁国人健康与生命的一种恶性肿瘤，近年来发病率及死亡率呈快速上升的趋势。胰腺癌早期无明显症状，难以发现，确诊时大多为进展期，又缺乏有效的治疗手段，故预后极差。因此针对晚期胰腺癌有效而不良反应低的治疗方法是目前研究的热点。本课题组先期研究以抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)作为靶点，将抗EGFR抗体偶联到载吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP)，用于治疗胰腺癌移植瘤，结果显示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效果不甚理想。近年来黏液蛋白1（mucin 1，MUC1）作为新的靶点进入了研究者的视野。因MUC1在胰腺癌组织的表达率高达80%， 故本课题组将抗MUC1单克隆抗体偶联到GEM-PBCA-NP，通过胰腺癌PANC1细胞株的体外实验，显示MUC1-GEM-PBCA-NP能抑制癌细胞的增殖。本研究进一步行MUC1-GEM-PBCA-NP治疗胰腺癌的动物体内实验。 一、材料与方法 1．MUC1-GEM-PBCA-NP制备：MUC1单抗购自Abnova公司。GEM-PBCA-NP的制备参考李春梅等方法。将GEM-PBCA-NP与抗MUC1单克隆抗体完全混合溶于pH7.4的SBF溶液, 低速磁力搅拌下按一定比例加入碳二亚胺溶液, 混均后离心取沉淀。超声分散沉淀物后，用去离子水洗涤4遍，冷冻干燥获取抗MUC1单抗与GEM-PBCA-NP的交联物（MUC1-GEM-PBCA-NP）。应用激光散射粒度分析仪（Zeta sizer Nano ZS90型，英国马尔文公司）观察微球粒的大小及抗体的分布，计算包封率及载药率。包封率=纳米微球粒实际载药量/总投药量×100%；载药率=纳米微球粒实际载药量/称取的纳米微球粒质量×100%。 2．体内抑瘤实验：人胰腺癌细胞株PANC1由北京富众科技发展有限公司提供,常规复苏、培养、传代。BALB/c裸鼠45只，5～6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。参考马琳等及李春梅等方法制备荷瘤裸鼠模型，即取0.2 ml（6×10 7/ml）PANC1细胞悬液注射于裸鼠右侧腋部皮下，待瘤体最大径0.5cm（需7～10 d）为建模成功。共39只裸鼠成功建模，按数字表法将其中35只随机分为5组，每组7只。MUC1-GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射2.5 mg/kg吉西他滨(gemcita bine,GEM)等药剂量的MUC1-GEM-PBCA-NP；GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射等药剂量GEM-PBCA-NP；GEM组：经尾静脉注射GEM 2.5 mg/kg；单纯纳米颗粒组(PBCA-NP组)，经尾静脉注射等容积PBCA-NP；对照组，经尾静脉注射等容积生理盐水。每5 d重复治疗1次，每3 d测量1次肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积（V），V=a×b 2/2。实验开始后第15天及第30天上IVIS·Lumina LT小动物活体成像系统（美国PerkinElmer）行活体生物发光检测成像并记录，生物发光实验参考王剑超等方法。第30天处死裸鼠，剥离瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率=［(对照组瘤重－实验组瘤重)/对照组瘤重］×100%。 3．统计学处理：使用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1．各组纳米粒子电镜下观察结果： MUC1-GEM-PBCA-NP组电镜下观察制备的纳米颗粒形态为光滑的球形，药物GEM细颗粒均匀地分散在聚合物基质中。GEM-PBCA-NP组和MUC1-GEMPBCA-NP组纳米粒大小分别为（49.62±6.17）nm和（58.14±6.44）nm。GEM-PBCA-NP组和MUC1-GEM－PBCA-NP组纳米粒中GEM的包封率分别为（44.52±4.22）%、（47.19±3.63）%，载药量分别为（7.24±0.71）%、（6.85±0.56）%。表面修饰后纳米粒子并无明显变化，表明MUC1-GEM-PBCA-NP靶向载药纳米粒子制备成功。 2．MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治疗后30 d，MUC1-GEM-PBCA-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组裸鼠的抑瘤率显著高于PBCA-NP组及对照组，MUC1-GEM-PBCA-NP组抑瘤率又显著高于GEM-PBCA-NP组、GEM组，差异均有统计学意义(P值均0.05)，而GEM-PBCA-NP组与GEM组抑瘤率差异无统计学意义（图1，表1）。 3．裸鼠移植肿瘤的光子量变化