北中大中药化学实验指导03综合实验项目-2银翘散抗流感病毒有效组分研究.docxVIP

实验二 银翘散抗流感病毒有效组分研究 银翘散为清代医家吴鞠通根据《内经》“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘;热淫于内，治以咸寒，佐以甘苦”的理论而创制的名方，临床应用已久，由金银花、连翘、牛蒡子、甘草、薄荷、荆芥、桔梗、淡豆豉、淡竹叶等9味药组成。始见于1788年出版的《温病条辩》。现代用于治疗流行性感冒、急性扁桃体炎、咽峡疱疹、麻疹、腮腺炎、乙脑、流脑、大叶性肺炎等疾病的初期阶段。现代药理实验表明银翘散具有良好的抗流感病毒活性。石任兵教授课题组以银翘散全方为研究对象，按传统用药方式，结合药效学实验，综合运用现代分离技术和方法，初步阐明了银翘散抗流感病毒作用的物质基础，并初步探讨了其作用机理。 一、银翘散抗流感病毒有效组分群的筛选 取银翘散原方(金银花:连翘:牛蒡子:甘草:薄荷:荆芥:桔梗:淡豆豉:淡竹叶为9:9:9:5:6:6:6:6:4)按传统用药方式，以水煎煮，得到水煎液。水煎液经过AB-8型大孔树脂柱处理，通过正交实验筛选，以抗甲型、乙型流感病毒为活性评价指标，采用鸡胚法和CPE法，筛选出了银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)。 二、银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定 采用多种分离纯化方法和结构鉴定手段（如UV、IR、EI-MS、ESI-MS、1HNMR、13CNMR等波谱学技术和化学方法），对银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，并对其中的31个进行了鉴定。1个为新化合物，8个为首次从银翘散中分得的已知化合物，其余为银翘散各单味药已有报道的化合物。 1.仪器与试剂 HMK 显微熔点仪（温度计未校正）。TU 1201 型 紫外可见分光光度计和U2000 紫外分光光度计。Nicolet Impact 410 型红外分光光度计，KBr压片。JEOL-300 型核磁共振仪、Varian Gemini-300 型核磁共振仪和Bruker AVANC -EDRX-500 超导核磁共振仪。VG-ZAB-HS 型质谱仪、VG-20-250 型质谱仪、Mariner 质谱仪和APEXⅡ FT-ICR 质谱仪。XZ-7 旋转蒸发器（中国科学院生物物理所科龙仪器厂）。SHZ-3 循环水真空泵(河南省巩义市英峪电子仪器厂)。H66025 超声波清洗仪（无锡市超声电子设备厂）。DS-Ⅱ 电热三用水箱（北京市医疗设备厂）。Waters Delta Perp 3000 制备液相色谱仪，Waters 484 可调波长紫外检测器。Waters 745 数据记录仪,流动相：甲醇-水系统。Gilson 制备液相色谱仪，Gilson 306 泵，Gilson 118 紫外/可见检测器，Gilson 712 化学工作站,流动相：甲醇-水系统。薄层层析和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂出品）。薄层展开系统:氯仿-甲醇。Sep -hadex LH-20（上海化学试剂采购供应站分装厂产品）。AB-8 型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂出品）。柱层析聚酰胺（上海化学试剂公司出品）。聚酰胺-6-薄膜（浙江四青生化材料厂产品）。展开系统：甲醇一水（4:1）。显色剂：10%硫酸乙醇溶液；1%三氯化铝乙醇溶液。所用有机溶剂均为分析纯。 2.提取分离流程 银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）经AB-8型大孔吸附树脂处理，水-乙醇梯度洗脱，分别得到30%、50%、70%和95%乙醇部分。各部分分别经聚酰胺柱层析，水-乙醇梯度洗脱，聚酰胺薄膜检测，合并相同组分.合并后的组分再行反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱；Sephadex LH-20柱层析，甲醇-水不同比例洗脱；硅胶薄层制备，氯仿-甲醇系统展开；HPLC制备，甲醇-水系统作为流动相。最后从 95 % 乙醇部分中得到4个单体化合物;从70%乙醇部分得到5个单体化合物；从50%乙醇部分得到18个单体化合物;从30%乙醇部分得到16个单体化合物。具体分离流程如下: 3.银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定 通过对银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，经理化常数测定及光谱解析，鉴定出其中的31个化合物，其中黄酮类17个、木脂素类3个、酚酸类5个和三萜类4个，其它2个。现以30%乙醇部分分得的化合物A为例说明结构鉴定的一般过程。 A为黄色结晶性粉末，mp 219-222℃，Mg-HCl 反应及 Molish 反应均呈阳性，酸水解检出半乳糖，示为黄酮苷类化合物。FAB-MS 给出准分子离子峰m/z465 （M+l）和碎片峰m/z 303 （M-Gal+1），结合1H 和13CNMR 数据推断分子式C21H32O12。据此计算不饱和度为12，推知A可能为单半乳糖苷。 IR光谱（KBr）cm-1：3240（OH），1650（α，β-不饱和C