丝素-磷酸三钙三层一体化高仿生支架生物安全性试验.docxVIP

丝素-磷酸三钙三层一体化高仿生支架生物安全性试验 近年来，国内外许多科学家在关节软骨缺损的基础上进行了应用组织技术的修复工作。 材料和方法 一、 小鼠、icr小鼠血清 丝素 (苏州大学) , β-TCP (上海贝奥路) , SD大鼠、ICR小鼠 (江苏省实验动物中心) , 胎牛血清、DMEM/F12 (Hyclone, 美国) , 青-链双抗、0.25%胰酶、Ⅱ 型胶原酶 (Gibco, 美国) , 转化生长因子β 二、 方法 三、 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (ue0af±s) 表示, 采用t检验, P0.05为差异有统计学意义。 结果 一、 中间过渡层、骨部分及孔隙率 三层一体化高仿生支架由软骨部分 (100%丝素蛋白, 孔径150-200μm, 孔隙率90% 以上, 厚度2-4mm) , 中间过渡层 (40% 丝素蛋白+60%β-TCP, 孔径30-50μm, 孔隙率75% 以上, 厚度2mm) , 骨部分 (100%β-TCP, 孔径400-500μm, 孔隙率70%以上, 厚度4-6mm) 所组成 (图1) 。 二、 呼吸抑制试验 实验组和对照组ICR小鼠腹腔注射浸提液和生理盐水后, 当时精神尚可, 活动自如, 未见呼吸抑制等不良反应。试验期各组动物活动、饮食、大小便均正常, 3d后各组动物未见中毒反应或死亡。两组间比较未见明显差异。 三、 动物术后体重、血常规 ICR小鼠腹腔植入支架2周内, 动物一般情况良好, 正常进食、毛发有光泽、大小便正常。体重与血常规见表1, 各组动物术前术后体重与血常规无统计学差异 (P0.05) 。8 周后取材, 小鼠的心、肝、肾肉眼观察无异常变化, 病理切片显示细胞形态正常, 均无组织变性、坏死、空泡变等异常。 四、 溶血试验 溶血试验结果显示溶血率为2.09%, 小于5%, 符合医用生物材料的溶血试验要求 (表2) 。 五、 细胞毒性试验 CCK-8试验结果显示细胞毒性评价结果均为合格, 证明支架对细胞的生长无毒性影响 (表3) 。 六、 软骨样的组织 培养4周后, 支架的软骨部分已被透明、有光泽的软骨样组织完全覆盖 (图1) 。染色结果示软骨细胞在丝素中黏附良好, 分布比较均匀, 胞外基质分泌较多 (图2) 。 影响生物安全性的试验 随着应用组织工程技术修复关节软骨缺损研究的深入, 有学者发现使用双层支架时会出现上层软骨细胞向软骨下骨迁移, 植入机体后软骨组织过度长入软骨下骨中, 缺损修复部位的潮线消失、软骨及软骨下骨结构异常等现象 为了解决上述问题, 我们选取丝素蛋白制作软骨组织工程支架、β-TCP制作骨组织工程支架, 在两者结合面制作一小孔径过渡层。其目的是: (1) 丝素蛋白为天然生物材料, 适合软骨细胞生长, 能够产生足量的胞外基质, 形成透明软骨组织, 同时可保持良好的机械性能, 具有较好的力学特性 由于支架是通过多步工艺流程制作而来的, 而制作工艺对支架的生物安全性可能会产生一定的影响 全身急、亚急性毒性试验是评价材料在短期内对生物体的毒性作用。它通过将材料与动物直接接触, 通过观察动物对其反应、体重以及血常规的变化从而判断材料是否有全身毒性。实验中动物活跃, 反应敏捷, 毛色光亮, 体重增加, 血常规正常, 8周后处死, 主要脏器无任何异常表现, 表明该支架无毒性。 溶血试验能敏感地反映材料对红细胞的影响, 被认为是生物安全性评价的一个重要补充。如果与血液直接接触的材料当中含有溶血成分, 可引起红细胞破坏从而导致游离血浆血红蛋白增加, 对机体产生毒副作用。实验结果显示溶血率为2.09%, 小于5%, 完全符合医用生物材料的溶血试验要求。 由于支架与细胞的细胞膜、细胞器、蛋白质合成、DNA合成会相互作用, 测定细胞的活性和死亡显得尤为重要。利用CCK-8行细胞毒性浸提液试验, 可以直观的观察到支架是否影响细胞功能。试验结果显示, 在不同浓度的浸提液培养下, 各时间点的细胞毒级均为0级, 表明支架对细胞生长无抑制和毒性作用。软骨细胞-支架复合组织块的番红、阿利辛蓝染色也说明了细胞在支架中生长良好、黏附佳、分布均匀, 细胞外基质分泌较多。 当然, 本实验也存在不足, 如缺乏长期肌肉植入试验、致畸突变试验、生殖发育毒性试验、致癌基因生物评价等, 我们会在未来的研究中进一步完善这些试验。 通过本研究, 可初步认为丝素/β-TCP三层一体化高仿生支架有良好的生物安全性, 基本符合组织工程理想支架材料的要求, 有广阔的临床应用前景。 1. 拉伸变形后的大鼠模具 β-TCP粉末滴入少量去离子水, 超声振荡处理30min形成浆液, 继续在超声振荡下将2.0质量百分比 (wt%) 丝素溶液滴加到β-TCP浆液中, 控制两者体积比为6∶4