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浅谈几种菌根菌的分离培养 1 牧草研究历史和分类 1.1 放线菌结瘤植物的固氮能力 在国外，关于法兰克福的细菌的研究正在推迟。1829年，有一篇关于类肿瘤的报道。 国内对弗兰克氏菌与放线菌结瘤植物研究起步较晚。1977年，中国科学院植物生理研究所曾探究放线菌结瘤植物木麻黄、胡颓子的固氮能力；1978年，中国科学院林业土壤研究所在全国范围内开展弗兰克氏菌宿主植物的资源调查，表明我国放线菌结瘤植物种类丰富，有5科6属44种 自1964年对弗兰克氏菌进行命名后的十四年间，对弗兰克氏菌的研究进展一直十分缓慢，大部分研究重心在资源调查与形态描述等宏观层面。1978年Callaham等 1.2 定种行为的研究方向 弗兰克氏菌的鉴定比较复杂，目前研究进展尚未满足确定的分类标准，所以当前世界公认弗兰克氏菌只分类到属，没有确切的种名。1970年，Becking根据弗兰克氏菌与宿主植物的关系将其划分为10个种，但因弗兰克氏菌对宿主的非专一性导致的交叉侵染能力不同使得该分类方法没有被认可 随着中性理论的提出、核酸演化速率的精准计算、分子钟的广泛应用和分子生物学的飞速发展，近二十年对定种问题的研究逐渐趋向于微观领域。合理运用DNA-DNA杂交、免培养技术、16Sr RNA高变区探针、高通量测序、特异性蛋白图谱及rm和nif基因序列分析、DNA限制性片段长度多样性（RELP）随机扩增DNA片段多态性（RAPD）等方法，对弗兰克氏菌的研究提高到一个新的水平，对分类到种的研究具有推动性。 依据Lechevalier判断标准，有如下定义标准为弗兰克氏菌的形态特征观察与初步鉴定提供借鉴：（1）分离出的菌株可以在宿主植物上诱发形成有效或无效根瘤，并能从根瘤中重新分离到纯培养；（2）可以在液体培养基中产生不动孢子的孢囊，有时可以形成泡囊 2 甲醇菌的形态特征和栽培特征 2.1 丝、孢囊、泡囊 弗兰克氏菌的纯培养过程中，其经典形态结构为菌丝、孢囊、泡囊，特殊结构为串珠状菌丝 (1）菌丝：植物体外培养环境下呈分枝状，粗细不均，波曲程度各有差异，菌丝有横隔，直径0.2～1.5μm 2.2 弗兰克氏菌培养特征 弗兰克氏菌是一类生长缓慢、用液体培养基培养和保存的微好氧放线菌。一般来讲，弗兰克氏菌的菌丝体常有的液体培养特征是在培养器的底端附着程度差别较大，菌落形态多呈絮状、颗粒状、圆球状、少数呈片状。一些菌株可以在固体培养基上生长，一般2～3周才能看见菌落，一些菌落可生长半年以上 3 分辨率与保存技术 3.1 酚类化合物干扰内生菌的分离与培养 导致弗兰克氏菌研究进展缓慢的主要因素是难以获得纯培养菌株，分析原因如下：（1）弗兰克氏菌在人工培养环境下生长缓慢，需半个月到一个月方可长成。（2）人工培养基难以满足根瘤内生菌营养方式与要求的转变。（3）环境中其他微生物的侵染、污染等。（4）根瘤内部产生酚类化合物干扰内生菌生存 随着对酶解法研究的深入，人们发现影响分离培养成败的关键因素是合理选用表面消毒剂和消毒时间，而对根瘤切片进行的酶处理只是有利于内生菌从宿主细胞中释放出来。根据目前全球各研究所分离情况可知，当前的弗兰克氏菌仍然是生长极其缓慢的，需要一年多才有较好的观察特征，这样的生长速度无法满足基础研究需求，更无法满足未来田间试验与广泛应用，因此加快分离菌株的生长速度成为亟待解决的问题。为解决此问题，在分离和生长培养基中一般要额外添加特殊促生长因子，譬如从赤杨皮根周围的油脂提取出来的三萜烯、龙脑香醇酮或类黄酮 Bassi等将吉兰糖胶作为一种胶凝剂和特定的蛋白胨而制成的一种新型固体培养基，在培养3 d后可用肉眼观察到弗兰克氏菌HFPCc13的衍生物。综上可知选择正确的培养基对弗兰克氏菌的分离可起到事半功倍的效应 3.2 弗兰克氏菌株的保存技术 到目前为止，已从木麻黄、杨梅、沙棘等诸多放线菌结瘤植物中得到弗兰克氏菌的纯培养菌株，但是弗兰克氏菌生长速度缓慢，对分离条件要求较高，且容易感染杂菌，因此如何妥善保存现有菌株显得尤为重要。苏岩凤等 4 弗兰克氏菌侵权形成根瘤 根据固氮菌与宿主和环境的关系可将生物固氮分为自生固氮作用、联合固氮作用与共生固氮作用，而以根瘤菌主导的豆科植物共生固氮体系、以弗兰克氏菌与丛枝菌根为主的非豆科共生固氮体系与固氮蓝细菌主导的蓝藻共生体系共同组成共生固氮作用 从根毛细胞侵染与根部薄壁细胞间隙侵入是弗兰克氏菌侵染宿主植物进行结瘤最常见的两种方式。例如，在弗兰克氏菌共生体系中木麻黄科植物与弗兰克氏菌结瘤是通过侵入根毛细胞内的感染方式结瘤，在胡颓子科中，早期的结瘤起始很可能通过从根毛表皮细胞间侵入形成根瘤。 (1）根毛侵染。弗兰克氏菌附着在根毛表面，引起根毛形态发生变化导致菌丝容易穿过细胞壁进入细胞形成内生菌。植物在感受到放线菌入侵后会发生应答反应，产生分泌物形成荚膜