羟基自由基的测定及其抗氧化活性的初步研究.docxVIP

羟基自由基的测定及其抗氧化活性的初步研究 氨基自由基（h）具有强烈的氧化能力，主要调节着生物体的动态平衡。但是如果新陈代谢时羟基自由基 (·OH) 生成过多, 会在生物体内氧化细胞膜、蛋白质和酶等各类生物大分子, 导致细胞氧化、衰老、凋亡, 对细胞进行致命性伤害。故近年来对各种抗氧化性物质研究甚多。由于·OH寿命短 (小于10 目前, 一般实验室采用分光光度法检测羟基自由基, 虽然这种方法干扰因素较多, 但简单实用, 所需设备常见。分光光度法测定羟基自由基是利用·OH容易攻击芳环化合物而产生羟基化合物的特点, 在体系中加入一些探针性物质, 利用生成物的量, 即体系反应颜色的变化来间接测定·OH的含量 1 羟基自由基检测方法 1.1 甲基亚磺酸探针 二甲基亚砜 (DMSO) 作为一种常见的溶剂, 在Fenton反应中作为羟基自由基探针, 使·OH转化为甲基亚磺酸 在此反应中, 甲基亚磺酸 (MSA) 能以稳定的状态存在。由于被测溶液在反应前的MSA含量为零, 故生成的MSA与羟基自由基含量有一定的关系。徐向荣 1.2 介质中黑色微酸性介质中各有转色剂,各中性介质中红色 茜素紫作为一种指示剂, 在强酸介质中呈现黄色, 微酸性介质中呈玫瑰红色, 中性介质中呈淡紫色, 强碱性介质中呈紫色再变为黄色。Co 张瑞菊 1.3 反应时间的确定 在p H=2~9时, 邻二氮菲与+2价亚铁离子 (Fe 利用邻二氮菲-金属离子-H 实验时需控制好反应时间, 37℃水浴, 50min为最佳反应时间 1.4 氧化酶自由基生成量的检测 在利用分光光度法测定羟基自由基时, 水杨酸是最常用的捕获剂, 其和羟基自由基反应产物是2, 3-二羟基苯甲酸和2, 5-二羟基苯甲酸。2, 3-二羟基苯甲酸的生成量与·OH反应的自由基的量成1∶1的关系, 从而达到间接测定自由基的目的。通过对反应体系影响条件 (吸收波长、反应物浓度以及反应时间、温度等) 的优化, 筛选出最佳反应物配比和最佳实验条件, 并对其稳定性进行检测。在此基础上, 再测定抗氧化剂对羟基自由基 (·OH) 的清除率。 盛伟等 因水杨酸自然氧化程度较低, 故作为分子探针可以准确表示羟基自由基的生成量。且该体系反应灵敏、稳定性高, 可作为抗氧化剂的筛选方法之一。 1.5 mb浓度对fenton反应的oh的影响 亚甲基蓝 (MB) 为对硫氮苯类显色剂, 其分子中含有与苯环相连的且带有孤对电子的氮硫的发色基团, 在664 nm处有最大吸收峰。在一定浓度范围内, 664 nm吸光度值与MB浓度呈线性关系。MB分子中有一个中间价态的硫原子, 其对·OH有高度的亲和性, 故可捕获Fenton反应产生的·OH。MB与羟基自由基反应, 生成羟化亚甲基蓝 (MB-OH) , 颜色由蓝色变为无色。其中的硫原子处于高价态, 不易被氧化;而且高价态的硫同样也不易被还原, 所以亚甲基蓝作为羟基自由基捕捉剂有很好的稳定性。因此, 可通过MB在664 nm时吸光度值的变化来间接反映·OH的含量 杨春维 该法的羟基自由基捕获率可以达到33%, 一般捕获剂都只有10%~20%。其精确度在各种测量方法中也是较高的 1.6 细胞色素c 在一定浓度范围内, 当Cu 张艳萍 1.7 三酚红色法的氯 溴邻苯三酚红 (BPR) 法与经典的Fenton法类似, 用H 1.8 其他方法 用紫外-可见光分光光度计测定羟基自由基的含量以及其清除剂的清除作用, 除了上述的几种捕获剂外, 还有溴甲酚绿 2 分光光度法的应用 分光光度法是利用羟基自由基使体系颜色发生变化, 根据吸光度值的变化从而间接测得自由基的含量, 被认为是最简便实用的羟基自由基的测定方法。由于受国内仪器和经费条件的限制, 绝大部分测定羟基自由基是用分光光度法来完成的。虽然该法操作简单方便, 但是间接测定干扰因素较多且不确定, 需根据操作环境选择合适的捕获剂, 确定最佳实验方案, 尽量减少干扰因素, 以尽可能达到最高效率的捕获, 从而减少实验结果与体内环境的差距, 使其逐渐趋于理想化。 羟基自由基的研究已不仅仅局限于生物化学领域, 很多方法已在医疗、环境治理等多领域得以应用。因此, 提高羟基自由基的捕获率以及灵敏度的深入研究有着重大意义。