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表达降尿酸氧化酶的大肠杆菌表达 uratase，ec.，是一种代谢形式中的酶。在大多数原核和真核组织中，钠酶可加速钠酶的氧化，形成尿囊素作为血液中葡萄糖代谢的最终药物。在人类和一些灵长类动物的进化过程中, 尿酸氧化酶基因因突变而丧失活性, 最终将尿酸作为嘌呤代谢的终产物。由于缺乏有活性的尿酸酶, 人类在过量食用海鲜、啤酒等富含嘌呤的食品后, 就会发生尿酸的积累, 导致产生尿酸盐结晶和痛风 1 1.1 材料表面 1.1.1 表达载体pet2、大肠杆菌表达宿主菌 大肠杆菌JM109为复旦大学遗传学教研室惠赠。表达载体pET28α、大肠杆菌表达宿主菌BL21 ( DE3) 为Novagen公司产品。克劳氏芽孢杆菌 ( 1.1.2 试剂 所有限制性内切酶、 1.2 方法 1.2.1 根据上述试验教材，提取窒息醇菌的基因dna和质量粒dna 质粒酶切、连接、转化等方法按文献标准方法进行 1.2.2 pcr扩增条件 根据NCBI公布的克劳氏芽孢杆菌基因组序列 PbcU01:AATTACCGGAATTCATGACGACGTTGGAAGAGC PbcU02:AATTACCGAAGCTTTCATAATCGCGCTTTCTCG 引物PbcU01与尿酸氧化酶基因I编码区5′端一致, PbcU02与尿酸氧化酶基因II编码区3′端互补, 引物中分别插入了 PCR扩增条件:在50 μL反应体系中加入克劳氏芽孢杆菌基因组DNA、引物PbcU01、PbcU02和 dNTP等材料后于96 ℃变性10 min。加入 将上述PCR产物以PCR纯化试剂盒纯化后以限制性内切酶 1.2.3 大肠杆菌nd-pce 重组质粒pET-BcU转化表达宿主菌大肠肝菌BL21 ( DE3) 感受态细胞得到大肠杆菌BL21 ( DE3) /pET-BcU。重组菌接种于30 mL 含50 μg/mL卡那霉素的LB 培养基, 37 ℃震荡培养过夜, 次日以2 %转接于30 mL LB 培养基, 37 ℃, 震荡培养至对 1.2.4 酶活性测定 酶活检测按参考文献 2 2.1 pcr扩增产物的酶切纯化 以克劳氏芽孢杆菌染色体DNA为模版, 用引物PbcU01、PbcU02作PCR扩增, 电泳结果表明, 在1.5 kb左右有一条明显的扩增带。将扩增产物酶切纯化后与经同样酶切的大肠杆菌表达载体pET28α连接, 连接产物转化大肠杆菌JM109, 随机挑选4个转化子进行酶切电泳鉴定。结果显示, 4个转化子用 对上述重组质粒pET-BcU的插入片段进行测序, 测序结果提交美国国家生物技术信息中心 (, NCBI) 进行序列搜索比对, 结果显示, 插入片段与 2.2 尿酸氧化酶基因表达 载体pET28α-BcU转化大肠杆菌BL21 ( DE3) 感受态细胞, 获得重组菌大肠杆菌BL21 (DE3) /pET-BcU。转化子以IPTG 诱导表达, 以SDS电泳检测蛋白表达, 结果显示重组菌BL21 (DE3) /pET-BcU胞内蛋白在38 kDa和23 kDa附近比含pET28α空质粒的重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET各多出一个蛋白条带。其中38 kDa的条带与 将重组菌BL21 (DE3) /pET-BcU和含空质粒的重组菌BL21 (DE3) /pET的细胞破碎液检测尿酸氧化酶酶活。结果显示重组菌BL21 (DE3) /pET-BcU细胞破碎液有明显尿酸氧化酶酶活, 酶活约为: 2.6 U/mL。含空质粒的重组菌BL21 (DE3) /pET破碎液没有酶活, 可见 2.3 重组酸酶的酶学性质分析 2.3.1 ph值对尿酸氧化酶酶活的影响 重组尿酸氧化酶 (BcU) 在pH值9.0 时的活力最强。pH值低于9.0时酶活迅速下降, 酶活高于9.0时酶活略有下降, 当pH值达到12时, 尿酸氧化酶酶活仍能保持80 %以上。由图3可见, BcU是一种适应高碱性环境的尿酸氧化酶。 2.3.2 酶的最适比例 BcU在35℃时酶活最高, 在30℃～45℃范围内酶活基本稳定, 均在最高酶活的70 %以上 (图4) 。温度达到50 ℃时酶活迅速下降。 2.3.3 温度对重组酶的影响 重组尿酸氧化酶在不同温度 (25℃、50℃、60℃) 下保温0～10 h, 酶液冷却后在35 ℃下测定剩余酶活, 绘出酶活变化曲线。结果表明, 在50 ℃以下条件下, 重组酶BcU基本稳定。温度达到60 ℃则酶活迅速下降 (图5) 。从酶活与温度的关系看 (图4) , 重组酶在50 ℃时酶活很低, 这应该是来源于酶在这一温度下变性失活。然而热稳定性试验却显示, 在50 ℃条件下即使长时间保温, 重组酶酶活仍能保持70 %以上。这一看似矛盾的现象可能源于尿酸氧化酶多聚体的结构特征。多聚体蛋白的亚基之间发生解聚的温度一般低