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啤酒中木聚糖的测定 近年来，小麦芽被广泛应用于啤酒行业的原料。由于高含量的大型木聚糖不能完全分解，啤酒生产过程中的高含量大米糖无法完全分解，导致低浓度的啤酒提取物、粘度、过滤时间延长、寒冷和浑浊，严重影响了啤酒的生产工艺和品质。木聚糖的基本结构是以(1→4)-β-D-吡喃木糖残基为线性骨干,通过C(O)-2,C(O)-3或C(O)-2,3键联上α-L-阿拉伯呋喃取代物,分子内部广泛交联,形成错综复杂的网状结构。目前尚没有测定木聚糖的标准检测方法,常规的分析测定方法主要有比色法、液相色谱法、气相色谱法。本实验通过对比木聚糖的高效液相色谱法和苯胺比色法进行研究,为啤酒生产企业生产过程中木聚糖的检测提供参考。 1 材料和方法 1.1 其它试剂检测 木糖对照品纯度≥99.5%;乙腈色谱纯;硫酸、氢氧化钠、苯胺、冰乙酸、超纯水;其它试剂均为分析纯。 高效液相色谱仪配示差折光检测器;天平精确到0.001g和0.0001g;真空旋转蒸发器,温控水浴锅,微孔滤膜(0.45μm),紫外分光光度计;p H计。 1.2 实验方法 1.2.1 用苯比色法测定木糖 1.2.1. 黑暗处的保存 显色剂的配制:取5mL的苯胺加入到100mL的冰乙酸中,密封,摇匀,置于黑暗处保存。 最大吸收峰的扫描:取1mg/m L的木糖标准溶液10mL置于试管中,加入5mL的显色剂,80℃中水浴加热15min,取出待冷却后,进行全波长扫描(200～600nm),蒸馏水做空白,绘制吸光度-浓度标准曲线。 1.2.1. 标准曲线的绘制 准确称取1g木糖标准品,溶解于1000mL的纯水中,配成1g/L木糖标准溶液,再稀释成2、4、6、8、10mg/L木糖标准溶液,取5支试管分别向其中加入1mL标准溶液和5mL显色剂,密封,在80℃中加热10min,取出静置冷却,在480nm处以蒸馏水做空白测定OD值,以浓度做横坐标,OD值做纵坐标绘制标准曲线。 1.2.1. 木聚糖水分含量的测定 取5mL的啤酒超声除气,稀释1倍,加入50mL 8%硫酸于100℃水解2h,与显色剂反应,冷却至室温后计算吸光度,按标准曲线直接测定木糖的浓度,将其乘以木聚糖聚合系数0.9为木聚糖的质量。 1.2.2 采用高效液相色谱法测定了木聚糖含量 1.2.2. 流动相、柱温、检测 色谱柱:键合氨基柱(5μm,4.6×250mm),4.6×250mm,5μm;流动相:乙腈∶水(75∶25,v/v);流速:1.0mL/min;柱温:35℃;检测器:示差检测器,35℃;进样量:10μL。 1.2.2. 木糖标准溶液的制备 分别吸取木糖标准品溶于1L容量瓶中,分别加流动相至刻度,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,即得木糖标准溶液系列,分别含木糖1、2、4、6、7mg/L。分别取10μL标准系列溶液进样分析,以木糖浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制木糖的峰面积-浓度标准曲线。 1.2.2. ph、硫酸水浴制备 啤酒水解后供试品溶液制备:取10mL的啤酒超声除气,置于25mL比色管中,加入4.0mol/L H2SO41mL,摇匀,于水浴80℃水解90min,取出,冷却至室温,加水10mL,加8.0mol/L氢氧化钠溶液中和硫酸(用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L硫酸溶液调pH至5～7),冷却后用纯水定容至刻度。精密量取溶液1mL置于10mL容量瓶中,加流动相定容至刻度,充分混匀后静置3min,用0.45μm微孔滤膜过滤,该溶液为水解后供试品溶液,总稀释体积V1=2500mL。 1.2.2. 4-样品测试 取啤酒水解供试品溶液10μL进行液相色谱分离测定,根据色谱峰保留时间定性,外标峰面积法进行定量。 1.2.2. 木聚糖含量的计算 根据待测供试品色谱峰面积,由标准回归方程式得啤酒样品中木糖含量,将其乘以木聚糖聚合系数0.9为木聚糖含量。 供试品中木聚糖含量按下式进行计算。 式中:M-啤酒样品中木聚糖含量;C1(g/L)-供试品溶液木糖组分浓度;V1(m L)-供试品溶液水解后的总稀释体积;V0(m L)-啤酒样品的取样体积;0.9-木聚糖聚合系数。 2 结果与分析 2.1 测定波长的确定 由图1可知,A曲线在波长480nm处和350nm处有最大吸收峰,但由于波长350nm离紫外区比较近,啤酒中其他物质如蛋白,多酚等具有较强吸光度,容易对测定结果产生干扰,而B、C曲线在480nm没有明显吸收峰,可排除背景干扰,所以选择480nm为木糖含量的测定波长。 2.2 标准比色法中的糖含量 以木糖浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,其标准曲线如图2所示,结果显示线性关系较好。 2.3 糖分离剂的检测 如图3所示,其木糖保留时间为7.325min,木糖与木二糖、木三糖、木四糖出峰时间不同,有较好的分离度,能较好地分离检测。图4为