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地衣芽孢杆菌发酵胡椒过程中酶活性的动态变化 柴胡是一种重要的亚热带香蒲植物，其占比超过60%。脱皮是白胡椒加工中的关键步骤,传统使用的水沤法脱皮周期长,劳动强度大,特别是沤臭味重,脱皮不彻底,产品质量不稳定。为了克服传统工艺的不足,近年来国内外都在寻求新的白胡椒加工方法,其中利用微生物发酵进行生物法脱皮是白胡椒加工的未来发展方向。 胡椒微生物发酵法脱皮的原理是利用接种的微生物产生各种酶类,分解果皮中的有机物质,从而破坏果皮的致密结构,即在温和条件下进行一系列“胶养菌,菌产酶,酶脱胶”的生化反应,使得果皮与胡椒种子(即胡椒粒)分离,达到脱皮目的。在这个生化作用过程中,所需酶类一般认为是两类,即果胶酶和半纤维素酶。在麻类脱皮的实验中,刘自镕等认为苎麻脱胶中的关键酶是果胶酶,Akin等和何连芳等研究麻类脱胶专用酶制剂时指出半纤维素酶和果胶酶共同作用才能使麻类脱胶的速度加快,且所得麻类品质更好。但对于胡椒脱皮过程中酶作用的动态变化的报道很少。传统水沤法脱皮是将成穗胡椒装在编织袋里,在自然水体中浸沤7~15d,然后在流水中搓洗胡椒使果皮脱除干净。其原理可能主要是自然水体中多种微生物的共同作用。由于许多腐败微生物参与该过程,因此所加工的白胡椒往往带有明显的沤臭味。本课题组致力于研究胡椒的生物法脱皮工艺,其中对胡椒在传统水沤法和地衣芽孢杆菌发酵法脱皮过程中生化指标特别是各种酶的变化进行研究,为阐明胡椒微生物发酵法脱皮的生物化学机制、为胡椒生物法脱皮的深入研究和进一步推广应用提供参考。 1 材料和方法 1.1 样品及水处理 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)3-x-05由海南大学食品学院应用微生物研究室筛选。 胡椒(Piper nigrum L.)鲜果及水沤处理中的胡椒采自海南省琼海市阳江镇。 果胶、D-半乳糖醛酸、木聚糖、木糖美国Sigma公司;羧甲基纤维素钠天津市光复精细化工研究所。 1.2 紫外-可见分光光度计 HM S智能型恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂;Hettich32R高速冷冻离心机德国Zentrifugen公司;W-1100型紫外-可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;Delta 320-S型p H计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SW-CT-IFD型超净工作台苏州佳宝净化工程设备有限公司;PB303-N型电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 酵母浸膏l 种子培养液:果胶2g/L、K2HPO42g/L、Na H2PO42g/L、(NH4)2SO4 2g/L、NaNO3 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母浸膏0.0001g/L。 直接用接种环从试管斜面上挑取2环地衣芽孢杆菌于种子培养基中,30℃、160r/min振荡培养24h。 1.3.2 地衣芽孢杆菌2-x-05种子液的制备 称取3000g成穗胡椒鲜果,热烫3min,添加1g/L的葡萄糖溶液,料液质量比1:3,接种10%的地衣芽孢杆菌3-x-05种子液,28℃静止培养直至72h胡椒脱皮完成(未脱皮颗粒在30颗以内,下同)。在脱皮过程中每隔6h定期取样,分别测定发酵液中的pH值和果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶的酶活力。 1.3.3 然水体浸法 海南省琼海市是胡椒的主产区,胡椒种植户生产白胡椒时均采用自然水体浸沤法,通常需要7~10d后。从农户的露天浸沤池中定期(每隔12h)吸取编织袋中央的沤液样品,同1.3.2节测定样品液中的p H值和果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶的酶活力。 1.3.4 ph测量 采用pH计测定。 1.3.5 力的测定方法 果胶酶系中聚半乳糖醛酸酶(PG)活力测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS)法。40℃、p H4.0条件下,1mL酶液中1min产生1μg半乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 果胶酯酶(PE)活力测定采用NaOH滴定法。45℃、pH6.0条件下,1mL酶液中1min释放出1μmol羧酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 果胶裂解酶(PL)活力测定采用紫外光谱仪测定吸光度法。40℃、pH5.0条件下,1mL酶液中1min分解果胶,波长235nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 木聚糖酶活力测定采用DNS法。50℃、p H7.0条件下,1m L酶液1min催化木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 纤维素酶系中滤纸酶活力和CMC酶活力测定采用DNS法。50℃、pH3.8条件下,1m L酶液1min水解纤维素底物生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 2 结果与分析 2.1 柴胡剥皮过程中果胶酶活力的变化 2.1.1 pg对pg蛋白表达的影响 PG专一水解果胶分子的糖苷键,属于果胶水解酶,