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守宫硫酸糖肽对人乳腺癌细胞skbr bfgf广泛存在于中颅层、神经外皮细胞和各种肿瘤细胞中，这对细胞的分配、分化和死亡调节发挥了重要作用。研究发现, b FGF作为血管生成因子, 能够诱导多种恶性肿瘤的血管生成, 同时促进多种肿瘤如肺癌、肝癌等实质细胞增殖。所以b FGF成为抗肿瘤研究的靶点。守宫是传统的中药材, 实为壁虎科动物的全体。守宫作为咸寒软坚中药, 长期用来治疗瘰疬, 守宫水提物守宫硫酸糖肽 (GSPP) 是其的有效成分。近期研究表明, 在血管内皮细胞中, GSPP作为b FGF的抑制剂, 可抑制b FGF引起的血管生成, 从而抑制肿瘤的生长和转移。目前GSPP在肿瘤细胞中对b FGF的作用仍然未知。2013年6~9月, 本文研究了GSPP对人乳腺癌细胞SKBR3增殖的影响及机制, 并验证SKBR3细胞中GSPP是否能够以b FGF为靶点抑制细胞增殖, 从而为GSPP的临床应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 fgf和gspp 人乳腺癌细胞株SKBR3由天津医科大学肿瘤研究所提供。b FGF购于美国Peprotech公司。GSPP由天津医科大学药学院提供。细胞周期流式检测试剂盒购于BD生物科技有限公司。Cyclin D1 ELISA试剂盒购于美国RD公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株SKBR3生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。 1.2.2 体外细胞计数 取对数生长期SKBR3细胞, 按1×104/孔细胞数接种于24孔板。待细胞贴壁24 h后, 分别加入GSPP 100μg/m L (GSPP组) 、b FGF 5 ng/m L (b FGF组) 、GSPP 100μg/m L联合b FGF 5 ng/m L (合用组) , 每组设3个复孔, 并设PBS阴性对照组。于37℃、5%CO2培养箱中培养。加药72 h后收集细胞, 用台盼蓝染色法进行细胞计数。细胞增殖抑制率 (%) = (1-实验组细胞数/对照组细胞数) ×100%。 1.2.3 pi/rnase染色 取对数生长期SKBR3细胞, 以1×105/孔细胞数接种于6孔板中培养24 h, 待细胞贴壁后给予药物处理, 加药浓度及细胞培养方法同1.2.2。72 h后收集细胞, PBS洗两遍, 用70%乙醇固定置于-20℃保存。分析结果前用PBS洗两遍, 重悬于PI/RNase染色缓冲液中。采用流式细胞仪检测细胞周期, 并用Mod Fit LT 3.3软件分析各周期的细胞比例。 1.2.4 裂解细胞制备 采用ELISA法。取对数生长期SKBR3细胞, 以3×104/孔细胞数接种于6孔板中培养24 h, 待细胞贴壁后给予同上药物处理, 每组药物设3个复孔。72 h后裂解细胞, 取细胞裂解液于-80℃储存。检测时将标本室温溶化后取10m L/孔上样, 摇匀后37℃孵育2 h, 缓冲液洗脱5次, 每次在吸水纸上拍干上样孔中残留液体, 加入二抗37℃孵育2 h, 同前方法洗脱5次, 加入显色液室温孵育半小时, 终止显色, 450 nm处测定吸光度, 记录结果。 1.2.5 统计方法 采用SPSS17.0统计软件, 数据以ue0af±s表示, 各组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 gspp单用对k-gf细胞增殖的影响 b FGF组、GSPP组、合用组及阴性对照组的细胞数分别为 (23.97±1.48) ×104/m L、 (6.72±0.88) ×104/m L、 (12.77±0.89) ×104/m L、 (13.92±0.84) ×104/m L。与阴性对照组比较, b FGF单用对SKBR3细胞增殖具有显著促进作用 (P0.01) ;而GSPP单用对b FGF有显著抑制作用 (P0.01) , 抑制率达51.74%;当两药物合用时细胞数比较无统计学差异 (P0.05) 。 2.2 gspp对g0/3g期细胞数的影响 阴性对照组G0/G1、S期细胞数分别为67.02%、22.91%, b FGF组分别为54.41%、30.95%, GSPP组分别为76.83%、17.38%, 合用组分别为64.42%、24.14%。与阴性对照组比较, b FGF组G0/G1期细胞数降低、S期细胞数增加 (P均0.05) ;GSPP组G0/G1期细胞数显著增多、S期细胞数降低 (P均0.05) ;合用组G0/G1期和S期细胞数无统计学差异 (P均0.05) 。 2.3 pg/msol 阴性对照组、b FGF组、GSPP组、合用组Cyclin D1水平分别为 (394.10±10.75) 、 (469.26±23.08) 、 (294.47±51.91) 、 (34