小麦木聚糖酶活性的动态变化及其基因表达.docxVIP

小麦木聚糖酶活性的动态变化及其基因表达 重金属是环境因素重要的环境污染物。随着工业化的发展和污染物排放量的增加，重金属引起的生态危机和生态后果引起了人们的高度关注。重金属胁迫下植物生长发育的生理生化和分子机制已成为当前的热点。种子萌发既是小麦生活周期的起点,也是小麦感知外界环境的最初生命阶段,萌发是代谢开始活跃,一系列蛋白酶及水解酶活性逐渐增强的过程。木聚糖酶是一类半纤维素水解酶,也是萌发过程中一个关键酶,目前研究较多的是细菌、真菌来源的木聚糖酶,对植物来源木聚糖酶的研究报道还很少。Chrispeels等发现大麦等禾本科植物在种子萌发时木聚糖酶活性在其他水解酶如淀粉酶等活性降低时仍持续升高,Banik等证实了在大麦种子萌发过程中,β-1,4木聚糖酶在基因表达上晚于(1,3-1,4)-β-葡聚糖酶。另外,在大麦种子萌发和幼苗形成过程中,糊粉层细胞合成并分泌水解酶到淀粉性胚乳中,给正在生长的胚提供营养,一旦完成它们的分泌作用,糊粉层细胞立即死亡,Caspers等通过试验证明细胞质中的一种内源β-1,4木聚糖酶在大麦(Hordeumvulgare)糊粉层程序性死亡中起重要作用。Bethke等认为GA促进糊粉层细胞水解酶的释放,导致PCD(Programmed Cell Death)发生,而ABA拮抗GA作用,抑制水解酶分泌。周建明Nemoto、LiL等认为干旱、高盐、病害等逆境条件可使小麦dil基因、WESR基因(小麦早期盐胁迫响应基因)、几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因表达增强。由此可见,木聚糖酶在种子萌发过程以及植物抗逆方面都有一定的潜在作用。因此,研究逆境胁迫下小麦籽粒发芽过程中木聚糖酶活性及基因表达的动态变化规律,对我们进一步探讨糊粉层细胞PCD的发生以及研究重金属对植物的危害机理都具有重要意义。本试验选定重金属As(Ⅲ)为胁迫因素,探讨不同浓度As(Ⅲ)处理后小麦籽粒发芽过程中不同部位木聚糖酶活性的动态变化,同时运用半定量RT-PCR(Semi-QRT-PCR)方法研究籽粒发芽过程木聚糖酶基因表达的动态变化,为研究逆境胁迫对小麦木聚糖酶表达的分子机理提供依据。 1 材料和方法 1.1 木聚糖酶活性测定 供试小麦(Triticum aestivumL.)品种为郑州9023,供试试剂为NaAsO2(A.R.)。 精选粒大饱满的小麦籽粒,用0.1%HgCl2表面消毒6min,去离子水充分冲洗后,整齐地摆放在铺有滤纸的培养皿中,每皿100粒,分别加入0(对照)、0.1、5、25 mg/L的As(Ⅲ)溶液,每个处理设3个重复,置于HP1000GS-B型全智能人工植物气候箱中在(18±2)℃,75%±7%RH,6000lx条件下培养,每隔半天补充定量的As(Ⅲ)溶液。从培养48h开始间隔12h连续取样,将取得的幼苗洗净,用滤纸吸干,分离成籽粒、幼根、幼叶3个部位,测定木聚糖酶活性;从培养后96h开始间隔12h连续取样,提取幼苗叶片的RNA,反转录为cDNA,半定量RT-PCR法研究木聚糖酶基因表达的动态变化。 1.2 木聚糖酶活性测定 取一定量新鲜的小麦籽粒、幼根及幼叶研磨,用pH5.3,0.05mol/L的柠檬酸缓冲液提取,8000r/min离心10min,在试管中加入2ml底物(1%桦木木聚糖Beechwood,Sigma),1ml提取酶液,DNS法测定木聚糖酶活性。以pH5.3条件下,50℃时每分钟水解木聚糖释放1μmol木糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U/g)。 1.3 小麦actin基因的扩增和克隆 用TRNzol试剂(TIANGEN)提取小麦幼叶的总RNA。(1)定量:测260、280nm处的吸光值,计算A260/A280的值,估计总RNA的纯度,通过A260的值分别对不同取样时间的总RNA进行定量。(2)RNA完整性的检测:在1%普通琼脂糖凝胶上分离总RNA,若有2条清晰无拖尾的带,则说明总RNA完整。(3)第一链cNDA合成:取等量不同取样时间的总RNA,用MMLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工)合成第一链cDNA。 根据小麦Actin基因(GenBank查询号:gi序列,设计了一对特异性引物Actin-F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′,Actin-R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。PCR扩增采用50μl反应体系,分别加入等量不同取样时间的cDNA(4μl)模板,10×PCR Buffer(100mmol/L的Tris-HCl,pH8.3,500mmol/L的KCl)2.5μl,80μmol/L的dNTP,1.5mmol/L的MgCl2,0.2mmol/L的Actin基因特异引物,1UTaqDNA聚合酶。反应程序:9