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小麦生理活性及木聚糖酶抑制蛋白活性动态变化 内切-1.4-木聚糖酶（ec3.2.1.8，以下简称木聚糖酶）是一种特殊的分解植物内膜中木聚糖酶。将木聚糖分解为木偶糖、木二糖和少量木糖。谷物中木聚糖酶在其细胞壁重建过程及贮藏器官和种子的营养物质动员中发挥作用。近年来,在小麦、大麦、玉米、燕麦、水稻等谷物中均发现木聚糖酶抑制蛋白成分的存在,其中以小麦中木聚糖酶抑制蛋白含量最高。至今已从小麦中得到三种木聚糖酶抑制蛋白,即TAXI (Triticum aestivumxylanase inhibitor)、XIP (xylanase inhibitor protein)、TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor),每种抑制蛋白都有若干同源物。不同抑制蛋白的分子量、等电点不同,对不同来源的木聚糖酶的抑制特异性也有差异,但有一点是共同的,即三种抑制蛋白都只作用于外源木聚糖酶,而对小麦内源性的木聚糖酶没有抑制作用。推测谷物中木聚糖酶抑制蛋白的存在并非植物本身代谢调节所需,而是植物防御病原菌入侵的一种机制。植物通过产生特定的木聚糖酶抑制蛋白,以识别病原菌所分泌的木聚糖酶,从而削弱病原菌对植物细胞壁的降解,避免其在植物上的定殖。因此木聚糖酶抑制蛋白也被归为植物防御相关蛋白。另外,对于需要外加微生物木聚糖酶制剂而进行的小麦加工过程,如小麦大麦混合啤酒酿制、面包焙烤、小麦谷朊粉-淀粉分离等,小麦自身木聚糖酶抑制蛋白的存在都会对外加木聚糖酶的活性产生阻碍作用,从而影响外加木聚糖酶的作用。因此很有必要了解小麦品种不同生育时期木聚糖酶活性及木聚糖酶抑制蛋白活性的动态变化。鉴于目前国内缺乏此类研究,本研究以小麦品种兰考矮早八和豫麦49为材料进行了此方面的分析和探讨,以期为进一步分离纯化小麦抑制蛋白或研究小麦抑制蛋白表达变化等工作奠定基础。 1 材料和方法 1.1 小麦材料 供试小麦为普通大田种植的兰考矮早八和豫麦49,均为河南大面积栽培的冬小麦品种。 1.2 籽粒取样方法 叶片的取样以小麦全生育期计,依表1时间进行。籽粒取样以小麦开花后的天数计,在开花后5、10、15、20、25、30 d取样。每次取样均取5株,计算其平均值和标准差。 1.3 小麦叶或籽粒的粗蛋白提取液的制备 称取1 g新鲜小麦叶(苗期是茎叶混合样)或籽粒,液氮研磨成粉末,并迅速转移至冰上预冷的离心管中,加入5 mL预冷的0.2 mol·L-1,pH 7.0磷酸缓冲液,在旋涡混合器上混合均匀,冰上放置30 min后,4℃、10 956 ×g离心10 min,取上清液装入透析袋中,4℃在30%聚乙二醇20000中浓缩过夜,然后向透析袋中加入1.5 mL同样缓冲液,溶解透析袋中沉淀,4℃、10 956 ×g再离心10 min,取上清液,即为小麦叶或籽粒的粗蛋白提取液。 1.4 还原糖含量的测定 取0.1 mL粗蛋白提取液,加入0.1 mL 2%桦木木聚糖(Sigma)底物溶液(用0.2 mol·μL-1、pH 4.6的HAC·NaAC缓冲液配制),在50℃保温15 min后,立即加入0.6 mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂,煮沸10 min显色,定容至5 mL,于550 nm波长下测定还原糖含量(以木糖计)。在上述条件下,以每分钟产生1 μmol木糖所需的酶量为1个酶活性单位(IU)。 1.5 木聚糖酶活性测定 以带有黑曲霉GH11木聚糖酶基因(EU375728)的巴斯德毕赤酵母GS115-xyn菌株(本实验室构建)作为木聚糖酶生产菌,该菌经甲醇诱导发酵,离心后上清即为木聚糖酶纯酶液。进行木聚糖酶抑制蛋白活性测定时,适当稀释木聚糖酶液,使其木聚糖酶活性测定OD550nm值在0.6～0.8(相当于0.92～1.23 IU木聚糖酶·mL-1)。取2份0.2 mL的木聚糖酶液,一份加入0.2 mL的粗蛋白提取液,另一份加入0.2 mL的0.2 mol·L-1、pH 7.0磷酸缓冲液,混匀,30℃保温30 min。从保温后的2份混合液中分别取0.1 mL测定其木聚糖酶活性。以加入缓冲液的反应管中的木聚糖酶活性为对照,加入粗蛋白提取液的样品管每降低0.01 IU的木聚糖酶活性定义为1个木聚糖酶抑制蛋白活性单位(IA)。 2 结果与分析 2.1 小麦叶片和籽粒中木聚糖酶活性的变化 不同时期测定结果(图1和图2)表明,小麦叶片和籽粒中的木聚糖酶活性在两个品种间均没有明显差异(成对测验P值分别为0.501和0.622),叶片中木聚糖酶活性在小麦全生育期及籽粒中木聚糖酶活性在灌浆～成熟期都没有显著变化,说明木聚糖酶在小麦叶片和籽粒中可能以基础水平存在。 2.2 小麦木聚糖酶活性检测 由于小麦中已知的三种抑制蛋白(TAXI、XIP、TLXI)均对来自真菌的GH11家族